Способ определения метаболитов витамина д в сыворотке крови
%Рю;Мд ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИН АВТОРСНОМУ СВИДЕТВЪСТВУ(ЛИТпн ГОСУДАРСТВЕННЬЙ КОМИТЕТ СССР. ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГПЙ(71) Институт питания АМН СССР(56) 1. Сх 1 Ьеггвоп Т., Бггуй К.Р.Н 1 яЬ-Регйопаапсе Ерп.й сЬогошагодгарЬус Аввау Гог 25-Нуйгохучдгаш 1 пР дп Бегпш. "С 1 ипса 1 СЬеш 1 вйгу",1977, ч. 23, р. 1700-1704,(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТАБОВ ВИТАМИНА Р В СЫВОРОТКЕ КРОВИ и добавления к образцу внутрен- стандарта, экстракции липидной фракции, хроматографической очисткина колонке с силикагелем с последующей элюцией и высокоэффективнойжидкостной хроматографии, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюупрощения способа, в качестве внутреннего стандарта используют 17-ацетат эквиленола, а элюцию с колонкис силикагелем проводят последовательно смесью гексан:хлороформ вобъемном соотношении 100:2, смесьюгексан:хлороформ:уксусная кислотав соотношении 100:10;2, хлороформом,смесью хлороформ:ацетон в соотношении 100:10 и смесью хлороформ:ацетон:уксусная кислота в соотношении50:50:1.1140Изобретение относится к аналити"ческой химии и может быть использовано в биохимии при исследованияхметаболитов витамина Э.В настоящее время известно околодвух десятков метаболитов витамина Р. Предлагаемый метод относитсяк определению трех важнейших из них,Это 25-оксихолекальциферол/25 (ОН)Р/,1,25-диоксихолекальциферол/ " 1 О1,25(ОН) Р/ и 24,25-диоксихолекальциферол/4,25(ОН)0 /. Эти веществаявляются биологически активными формами витамина Э в организме человека.Известен способ определения метаболитов витамина Р в сыворотке кровипутем добавления к образцу внутреннего стандарта, экстракции липиднойфракции, хроматографической очисткина колонке с силикагелем с после Одующей элюцией и высокоэффективнойжидкостной хроматографии. Способзаключается в добавлении к 1 мл сы- .воротки меченого тритием стандарта./3 Н/ - 25-оксихолекальциферола и 25последующей экстракции образцасмесью хлороформ-метанол (2:1),Затем экстракт очищают на микроколонке с силикагелем 0,5 2 см. Первуюфракцию элюируют 2 мл гексана, вторую фракцию 7 мл смеси хлороформ-гексан (3:2). Эти фракции отбрасывают.Метаболит элюируют 7 мл смеси хлороформ-гексан (3:2). Образец упариваюти определяют концентрацию 25(ОН)З35помощью высокоэффективной жидкостнойхроматографии и изотопного анализа Г 1 Д.Недостатком известного способаявляется его сложность и длительность. 4 ОЦель изобретения - упрощение способа. Указанная цель. достигается тем, что согласно способу определения метаболитов витамина 2 в сыворотке крови путем добавления к образцу внутреннего стандарта, экстракции липидной фракции, хроматографической очистки на колонке с силикагелем с последующей 3 люцией и высокоэффек О тивной жидкостной хроматографии, в качестве внутреннего стандарта ис" пользуют 1-ацетат эквиленола, а элюцию с колонки с силикагелем.проводят последовательно смесью гексен: 55 хлороформ в объемном соотношении 100:2, смесью гексан:хлороформ;уксусная кислота в соотношении 1.00:10:2,039 2хлороформом, смесью хлороформ:ацетон в соотношении 100:10 и смесью хлоро-; форм:ацетон;уксусная кислота в соотношении 50:50:1. П р и м е р. К 1 мл исследуемой сыворотки крови добавляют 25 мг 17-ацетат эквиленола в 100 мкл этанола и перемешивают в течение 10 мин. Затем проводят экстракцию, добавляя 3,75 мл смеси гексан-изопропанол (1:2), 5 мин перемешивают и добавляют еще 1,25 мл гексана, и после тщательного перемешивания центрифугируют при 1000 об/мин 10 мин.Органическую фазу отбирают, а остаток экстрагируют гексаном (1,25 мл х 2) . Объединенный экстракт упаривают и переносят на микроколонку в гексане (0,25 мл,х 2). Предварительную очистку проводят на автоматическом процессоре образцов РНЕРфирмы Эц РопГ 3 псггцшепгз (США) с двенадцатиколончатым ротором с модифицированными стеклянными колонками ббх 3 мм на силикагеле КБ 1 Ь РКЕРБЕЬ 1 СА с диаметром частиц 25-40 мкм фирмы А 11 гесЬ Аззосдагез (США) при скорости1000 об/мин 4 мин. Первую фракцию элюируют 2 мл смеси гексан-хлороформ (100:2); вторую 2 мл смеси гексанхлороформ-уксусная кислота (100: 10:2); третью фракцию, содержащую 25(ОН)Э , элюируют 2 мл хлороформа, четвертую фракцию 2 мл смеси .хлороформ-ацетон (100:10), 1, 2 и 4 фракции отбрасывают. Пятую фракцию, содержащую 1,25(ОН) П и 24,25(ОН) П,5 элюируют 2 мл смеси хлороформ-ацетон- -уксусная кислота (50: 50: 1) . Фракции, содержащие метаболиты, упаривают досуха под вакуумом при температуре не более 40 С, переносят в конические флаконыОобъемом О, 3 мл, перерастворяют в 50 мкл смеси гексан.-изопропанол (90;10) и анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе 322 МР, АПЕК (США) на колонке ц 1 ггазрйеге Б 1 (5 мкм 4 бх 250 мм). Детектирование при длине волны 265 нм. Элюирующая система гексан-изопропанол (90:10), Расчет осуществляют по калибровочному графику. Для его построения определяют отношение высот пиков 25(ОН) П. и 17-ацетат эквиленола призначениях 25 (ОН) 0, равных 5 нг, 10 нг,25 нг, 50 нг и 100 нг В данном примере отношение высоты. пика 25(ОН)П.у к высоте пика 17-ацетат эквиленола равно1140039,По калибровочному .графику определяют концентрацию 25(ОН)0 равную29 нг/мл.Другие примеры определения концентрации 25(ОН)П с помощью описанного метода представлены в таблице.( 3Высота пика 25(ОН)Р Концентрация25(ОН)Ро , определенная методом ВЖХ,мг/мл Истинная концентрация25(ОН)П, мг/мл Образец 10 10,5 20 21 26 30 31 41 50 50,5 60 60 70 70,5 80 80 10 По сравнению с известным предлага. емый способ обеспечивает упрощение, сокращение времени анализа, возможСоставитель Н. ГуляеваРедактор Т. Колб Техред А.Кикемезей Корректор И. Муска Заказ 256/34 Тираж 897 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 Высота пика 17-ацетат эквкпенола47 мм---= 0,6572 мм ность максимальной автоматизации и повьппение достоверности получаемых результатов
Заявка
ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ АМН СССР
АРХАПЧЕВ ЮРИЙ ПЕТРОВИЧ, ЛИНБЕРГ ЛЕОНИД ФЕДОРОВИЧ, МИРИМСКИЙ АЛЕКСАНДР САМУИЛОВИЧ, СПИРИЧЕВ ВЛАДИМИР БОРИСОВИЧ
МПК / Метки
Код ссылки
<a href="https://patents.su/3-1140039-sposob-opredeleniya-metabolitov-vitamina-d-v-syvorotke-krovi.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ определения метаболитов витамина д в сыворотке крови</a>
Устройство для регулирования соотношения смеси с заданным объемным весомНомер патента: 379858
. - в сумматоре 10 веса керамзитового гравия.Песок из бункера 11 разгружается автоматическим дозатором 12 с разомкнутым контуром регулирования. Объем разгружаемого песка контролируется индуктивным датчиком 13 положения шибера дозатора песка, а вес - индуктивным датчиком 14 веса песка.Суммарный сигнал объемов керамзитового гравия и песка поступает в регулятор 15, который через усилитель 16 управляет исполнительным механизмом 17 шибера дозатора песка. Необходимый объем смеси задается задатчиком 18 объема.Суммарный сигнал веса керамзитового гравия и песка поступает в регулятор 19, который через усилитель 20 управляет исполнительными механизмами 21 шиберов дозаторов керамзитового гравия. Необходимый вес смеси задается задатчиком 22 веса. Для.
Способ определения количественного соотношения смеси сыпучих материалов и устройство для его осуществленияНомер патента: 1453367
. выходные отверстия 3 и 4 которых расположены над движущимся конвейером 5, Перед каждым выходнымотверстием 3 и 4 дозирующего бункераустановлен барабан 6 с намотанным нанем гибким полотном 7, на выходномконце 8 которого закреплена петля 9,а на конвейере установлен поводок 10для зацепления с петлями 9 барабанов6 в процессе прохождения поводка 10вдоль дозирующих бункеров. Составитель В.ПодражанскийРедактор Л,Гратилло Техред М.Ходанич Корректор С.Черни Заказ 728344 Тираж 788 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР13035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород. ул. Проектная, 4 Изобретение относится к способами устройствам для определения.
Способ получения стероидных (16, 17 )-циклогексен-или нафталин-21-карбоновых кислот или их сложных эфировНомер патента: 946404
. примерно эквимолярной смесью производных 21-альдегида и 21-диметилацетата исходного стероида.1,3 г твердого продукта описанной реакции перемешивают в смеси 50 мл сухого метанола и 50 мл сухого дихлор 45 метана при комнатной температуре в течение 16 ч с 2 г активированной двуокиси марганца,1 мл ледяной уксусной кислоты и 200 мг цианистого калия, Суспензию фильтруют через слой и про 50 мывают хлороформом, фильтрат и промыв. ную жидкость объединяют, промывают водой и сушат безводным сульфатом магния. Растворитель выпаривают в вакууме и получают 1,1 г твердого вещества. Бго снова растворяют в хлоро 55 .форме и хроматографируют на колонке с силикагелем весом 35 г, Элюирование хлороформом дает 30 мг материала,04 8Кристаллизацией из.
Способ получения производных 1, 2-дитиолановНомер патента: 683622
. г этилвалерата и 63,7 г трет-бутилата натрия, суспендированпых в 1400 мл сухого толуола. Таким образом получают 133,4 г этил-пропил-(3 - ппридазинил) - 3-оксопропионата в виде масла коричневого цвета.П р и м е р 12, Следуя методике примера 10, но из 58 г этил(6-диметиламино- пиридазинил)-2-этил - 3-оксопропионата и 73 г пентасульфида фосфора, суспендированных в 1160 мл толуола, получают после перекристаллизации из 38 мл 1,2-дихлорэтана 5,7 г 5-(6 - диметиламино-пиридазинил) -4-этил,2-дитиол-З-тиоа, плавящегося при 160 С, затем 164 С.Этил -3-(6 - диметиламино- пиридазинпл)-2-этил-оксопропионат получают из 57 г этил-(6-диметиламино-пиридазинил)- карбоксилата, 67, г этилбутирата и 56 г трет-бутилата натрия, суспендировапных в 1260 мл сухого.
Способ получения производных 2 карбалкоксиаминобензимидазола или их солейНомер патента: 727143
. нейтрализуют насыщенным растворе б .карбоната калия, добавляют 40 хлороформ, фильтруют, хлор оформныйслой отделяют, высуиивают и упаривают, получая 12-диаминов (проп-ин-илтио) -бензол. Общий выход7 эь4,0 г 1,2-диамино-(проп-ин в илт) -бензола в 25 мл этанола.и25 мл воды обрабатывают 4,9 г 1, 3 - бис- (метоксикарбонил) -Б-метилизотио;1 счевины и 1, 5 мл уксусной кислотыпри нагревании с обратным холодильником в течение 3 ч, охлаждают, 5 (6).- (проп-ин-илтио) -2-карбометоксиаминобензимидазол отфильтровываюти при желании перекристаллизовываютиз смеси метанол-хлороФорм,т. пл. 212212,5 ОС; выход 92.1, 31 г 5 (6) - (проп-ин-илтио)- -2-кар бометоксиаминобен эимидаэоларастворяют в смеси 65 мл уксусной кислоты и 65 мя хлороформа.