Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему: Использование клубней георгины простой как альтернативного источника получения инулина

Автореферат диссертации по медицине на тему Использование клубней георгины простой как альтернативного источника получения инулина

На правах рукописи

АНАНЬИНА НИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КЛУБНЕЙ ГЕОРГИНЫ ПРОСТОЙ КАК АЛЬТЕРНАТИВНОГО ИСТОЧНИКА ПОЛУЧЕНИЯ ИНУЛИНА

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

диссертации на соискание учёной степени $ 3 ['' Р ?П'!1

кандидата фармацевтических наук

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Оганесян Эдуард Тоникович

доктор фармацевтических наук, профессор Денисенко Олег Николаевич

доктор химических наук, профессор Озеров Александр Александрович

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «16» февраля 2011 года в 9-00 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.069.01 по защитам диссертаций при ГОУ ВПО. «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, И).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Автореферат разослан «15» января 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета д.ф.н., профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Среди эндокринных заболевший! на долю ахарного диабета приходится примерно 70%. Смертность от данного аболевания занимает третье место после сердечно-сосудистых и нкологических заболеваний.

В настоящее время фитотерапия является одним из распространённых етодов профилактики и лечения инсулиннезависимого сахарного диабета, в вязи с чем широкое применение получили инулинсодержащие субстанции, пектр действия инулина достаточно разнообразен благодаря его высокой ипогликемической, гиполипидемической, гипохолестеринемической ктивности. Являясь препаратом выбора в фитотерапии инсулиннезависимого ахарного диабета и проявляя пребиотический эффект, он находит широкое рименение за рубежом. Наряду с этим данный полисахарид является сточником промышленного получения фруктозы.

В России в качестве инулинсодержащего сырья рекомендованы клубни опинамбура, однако себестоимость чистого инулина из этого сырья остаточно высока. Это объясняется тем, что помимо инулина клубни опинамбура содержат карамелеобразующие фруктозаны с более низкой олекулярной массой, из-за чего возникает ряд проблем с технологией ыделения и очистки инулина. Одновременно с этим возникает необходимость нактивации ферментов с помощью лиофильной сушки, денатурации рганическими растворителями, воздействия высоких температур.

Альтернативным топинамбуру сырьём являются клубни отдельных видов еоргин, которые используют как в США (вид Dahlia imperialis), так и в странах нвропы (вид Dahlia variabilis) в качестве источника промышленного получения нулина. Георгины относятся к неприхотливым с агротехнической точки рения растениям, урожайность может достигать 2,5 кг с 1м2. Поскольку в убнях георгин отсутствуют карамелеобразующие фруктозаны и ысокоактивные энзимы, способствующие осмолению полисахаридов, ыделение и очистка инулина из данного сырья не требует применения

трудоёмких и дорогостоящих приёмов. Таким образом, клубни георгин . являются наиболее подходящим сырьевым источником как с технологической, так и с экономической точек зрения.

Исходя из вышеизложенного, мы считаем, что поиск оптимальных путей получения инулина из альтернативного инулинсодержащего сырья - других видов клубней георгин, а также изучение возможности применения самих клубней георгин в фитотерапии инсулиннезависимого сахарного диабета является актуальным вопросом.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является экспериментальное обоснование применения клубней георгин в качестве альтернативного топинамбуру инулинсодержащего источника, а также разработка оптимальных способов получения и очистки инулина из данного сырья.

Для реализации поставленной цели мы сочли необходимым решение следующих задач:

- экспериментально обосновать возможность применения клубней георгины простой в качестве источника инулина;

- разработать оптимальные условия выделения инулина;

- провести химическое исследование клубней георгины простой на присутствие основных групп БАВ и разработать методику количественного определения инулина в сырье;

- изучить влияние высокоочищенного инулина и порошка измельчённых клубней георгины простой на углеводный обмен при экспериментальном сахарном диабете.

Научная новизна. Предложен технологически доступный метод получения полиморфных форм инулина (а-, 0-, "/-инулин) из клубней георгины простой, как альтернативного инулинсодержащего с^рья. Разработаны оптимальные условия выделения инулина из свежего сырья, сока клубней георгин, а также сухого сырья, более устойчивого к хранению.

Для полученного высокоочищенного инулина определены числовые показатели качества, соответствующие требованиям зарубежного стандарта fficial Monographs «Inulin» (The United States Pharmacopoeia, XXII).

Усовершенствована и вапидиропана методика количественного пределения инулина в клубнях георгины простой, согласно которой одержание полисахарида рассчитывается как разница между суммой |)руктозидов-фруктозанов, экстрагируемых из сырья водой очищенной, и уммой фруктозидов, извлекаемых 95% спиртом этиловым.

Проведено химическое изучение клубней георгины простой, определено оличественное содержание таких биологически активных соединений, как олисахариды, аминокислоты, макро- и микроэлементы, органические кислоты, енольные соединения.

В ходе фармакологических исследований на модели экспериментального ахарного диабета установлено, что высокоочшценный инулин, а таюке орошок измельчённых клубней георгины простой существенно понижают 'ровень глюкозы в крови при моделировании сахарной нагрузки, ограничивают ипергликемию, лактат-ацидоз, а таюке предотвращают активизацию процессов ерекисного окисления липидов (ПОЛ), являясь, таким образом, эффективным редством коррекции углеводного, липидного и белкового обмена при ахарном диабете. -

Практическая значимость работы. На основании проведённых кспериментальных исследований доказана целесообразность применения лубней георгины простой в качестве альтернативного топинамбуру источника шулина.

Изучение фармакологической активности инулина, полученного из ■лубней георгины простой, а также порошка измельчённых клубней георгины ростой позволяет рекомендовать их для дальнейших углублённых сследований.

Внедрение результатов в практику. По материалам диссертации оставлено информационное письмо «Обоснование применения

высокоочищенного инулина из клубней георгины простой для коррекции экспериментального инсулнннезависимого сахарного диабета», которое передано в НИИ питания РАМН для дальнейших возможных совместных исследований, о чём имеется соответствующий акт внедрения.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Пятигорской государственной фармацевтической академии Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию» (№ государственной регистрации 01200411089).

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены на 63-й, 64-й и 65-й научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2008-2010гг.). По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Положения, выдвигаемые на защиту:

- обоснование использования клубней георгины простой в качестве источника получения инулина;

- разработка методики получения полиморфных форм инулина (а-, р-, у-инулин), определение показателей качества высокоочищенного инулина;

- результаты химического исследования основных групп БАВ клубней георгины простой;

- результаты предварительного фармакологического исследования влияния высокоочищенного инулина и порошка измельчённых клубней георгины простой на основные показатели углеводного обмена при экспериментальном сахарном диабете.

итературы, включающего 155 источников, в том числе 70 иностранных, риложения; содержит 52 таблицы, 20 рисунков и приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обоснование выбора георгины простой (Dahlia single L.) в качестве ипулипсодержащего сырья

Предварительно с целью выбора объекта исследования были роанализированы пять сортов георгин (Георгины простые, Звезда Востока, улейман Стальский, Гзллери, Невеста), наиболее распространённых на "дверном Кавказе. Указанные сорта относятся к виду Георгина немахровая Dahlia linearis). Клубни собирались в фазу плодоношения растения на первом, тором и третьем годах жизни. Выделение инулина из исследуемых сортов роводили по общепринятым методикам, основанным на экстракции инулина 13 сырья водой. Содержание полученного инулина колеблется в пределах'6-10% в пересчёте на сухое сырьё.

Было установлено, что в качестве альтернативного инулинсодержащего ырья наиболее целесообразно использовать клубни георгины простой, обранные в фазу плодоношения на втором году жизни растения. В пользу акого выбора свидетельствует высокий выход нативного инулина, а также его нешние признаки - окраска от светло-серой до серой, нейтральный вкус я тсутствие запаха.

В ходе разработки методики получения инулина из клубней георгины ростой было изучено влияние на полноту экстракции данного полисахарида гаких факторов как состояние сырья (свежие или воздушно-сухие клубни), епень измельчения, соотношение сырья и экстрагента, время и кратность кстракции, температурный режим. Результаты исследований показали, что птимальная экстракция достигается при использовании в качестве экстрагента оды очищенной, измельчении сырья до размера частиц 1-3 мм, а также агревании на кипящей водяной бане в течение 1 ч, при соотношении сырьё : кстрагент 1:4 (табл. 1). На основании полученных экспериментальных данных

были обоснованы оптимальные методики выделения и очистки инулина как из свежего, так и сухого сырья, а также из сока клубней георгин. Содержание инулина достигает до 22% в пересчёте на сухое сырьё.

Таблица 1 - Результаты исследования условий экстракции инулина из клубней

Условия экстракции серия 1 серия 2 серия 3 серия 4 серия 5

Вид сырья (клубни георгины простой)

Свежие клубни 10,2 12,4 9,8 11,5 10,4

Воздушно-сухие клубни 9,5 9,2 10,8 9,3 10,2

Влияние степени измельчения сырья (воздушно-сухне клубни)

Более 7 мм 7,1 6,4 7,1 5,9 6,7

7 мм 7,9 8,1 7,1 7,5 7,5

5 мм 8,5 9,3 8,5 8,7 8,6

3 мм 10,3 9,4 8,9 10,9 9,1

2 мм 9,2 11,9 10,3 9,3 11,7

1 мм 10,5 9,7 10,8 14,5 12,2

Влияние температурного режима экстрагирования

Без нагревания 1,1 0,6 0,5 0,9 ' 1,2

Вод. баня, 40°С 5,1 5,3 4,2 4,8 4,2

Вод. баня, 60°С 9,5 13,3 10,4 12,4 16,7

Вод. баня, 80°С 15,1 12,4 10,5 18,2 16,5

Вод. баня, 100°С 9,8 8,7 8,3 8,1 8,7

Открытый огонь 7,9 7,6 8 7,4 6,6

Влияние времени экстрагирования

15 мин 5,2 6,1 4,1 5,7 4,4

30 мин 7,7 8,3 7,4 8,8 8,9

45 мин 9,8 9,1 10,3 9,5 8,7

1ч 12,4 16,5 10,1 19,2 19,4

1,5 ч 9,4 10,5 9,3 14,9 9,1

2ч 8,8 8,4 8,5 7,4 8,9

Влияние соотношения сырья и экстрагснта

1:2 8,5 9 9,4 10,6 8,6

1:3 14,8 10,1 12,4 10,8 9,2

1:4 17,2 13,1 16,2 10,5 17,8

1:5 16,2 11,8 14,2 10,5 15,3

По разработанной методике очистки инулина от сопутствующих БАВ были получены три образца целевых продуктов, содержание в виде примеси аминокислоты в количестве 2,34%, 0,93% и 0,53% соответственно с преобладанием кислоты аспарагиновой.

Таблица 2 - Аминокислотный состав последовательно очищенных инулинсодержащих фракций, полученных из клубней георгины простой

Фракция 1 Фракции 2 Фракция 3

Кислота аспарапшовая 0,93 0,3 0,27

Треонин* 0,04 0,04 0,01

Серии 0,07 0,04 0,02

Кислота глутамнповая 0,5 0,12 0,1

Глицин 0,07 0,04 0,01

Алашга 0,1 0,03 0,01

Валин* 0,07 0,04 0,01

Изолейцип* 0,05 0,05 0,01

Лейцин* 0,05 0,05 0,01

Тирозин 0,1 0,06 0,03

Фешшалашш* 0,07 0,01 0,01

Гистидин 0,07 0,03 0,01

Лизин* 0,08 0,05 0,01

Аргинин 0,14 0,07 0,02

итого 2,34 0,93 0,53

Примечание - * - незаменимые аминокислоты

Известные сведения о растворимости инулина противоречивы, что, по-видимому, объясняется существованием трёх полиморфных форм инулина -альфа, бета и гамма, отличающихся между собой растворимостью в воде. Нами были получены и охарактеризованы все три формы инулина.

а-Инулгш - кристаллы различной формы, полученные вымораживанием инулина из водных растворов (при -3. -10°С в течение 5-10 дней). Растворим в воде при 37°С, величина удельного вращения составляет -37,2±0,3°. С помощью сканирующей электронной микроскопии (растровый электронный микроскоп S-3400N фирмы Hitachi, Япония) был определён размер частиц а-инулина, который составил 50-100 микрон.

[¡-Инулин - аморфная форма, полученная осаждением из водных растворов органическим растворителем (95% спиртом этиловым или ацетоном в соотношении 1:2). Хорошо растворим в воде при 23°С, величина удельного вращения составляет -36,6±0,2°. Размер частиц р-инулина составляет 1-20 микрон.

у-Ииутш образуется из растворов а- и р-инулина в виде аморфного осадка. Растворим в воде при 70-80°С, величина удельного вращения составляет-34,4±0,2° Размер частиц - 1-20 микрон (рис. 1).

Примечание - а) а-инулин (увеличение 200х); Ь) Р-инулин (увеличение ЮООх); d) у-инулин (увеличение ЮООх)

Рисунок 1 - Результаты сканирующей электронной микроскопии полиморфных форм инулина Определение структурных характеристик и показателей качества высокоочищенного инулина, полученного из клубней георгины простой Выбор показателей качества полученного инулина осуществлён согласно перечня требований к инулину зарубежного стандарта Official Monographs «Inulin» (The United States Pharmacopoeia, XXII).

Результаты анализа показывают, что полученный инулин соответствует требованиям зарубежного стандарта.

Таблица 3 - Результаты определения показателей качества инулина,

юлученного из клубней георгины простой

Показатели Результаты анализа* Нормы**

Потеря в массе при высушивании, % 8,75±0,01% Не более 10

Общая зола, % 0,15±0,004% Не более 0,17

Полнота растворения при 100°С (10г/200 мл раствора) Бесцветный раствор с лёгкой опалесценцией Прозрачный раствор

Кальций, % 0,07±0,001% Не более 0,10

Сульфаты Не обнаружены Не допускается

Железо Не обнаружено Не допускается

Тяжблые металлы Не обнаружены Не допускается

Содержание основного вещества, % 95,23±1,40% Не менее 90%

Содержание связанной глюкозы, % 4,33±0,07% 2-5%

Содержание свободной фруктозы Не обнаружено Не более 2%

Примечание -г * - приводятся усреднённые данные шести определений; **

требования к чистому препарату Official Monographs «Inulin»

С использованием жидкостного хроматографа Rheodyne system, снащённого рефрактометрическим детектором, с последующей компьютерной бработкой результатов определено содержание низкомолекулярных омпонентов инулина, а именно, глюкозы <0,1%, сахарозы 0,6%, олигомеров со епенью полимеризации (DP) DP2 2,8%, DP3 4,7%, DP5 10,5%.

Хромато-масс-спектрометрически (ГЖХ/МС) определены нейтральные ахара и олигомеры с DP меньше 17 (глюкоза <0,1%, сахароза 0,3%, F2 фруктоза ,,=2) 2,4%, F3 4,6%, F4 5,8%, F5 9,8%, F6 9,1%, F7 11,1%, F8 15,1%, F9 12,9%, F10 15,5%).

Идентификацию данных компонентов в кислотном гидролизате инулина роводили методом ГЖХ/МС в виде ацетатов полиолов на газовом роматографе G2589A (Agilent Tech., США) с масс-селективным детектором 973 INERT (Agilent Tech., США).

Для определения структурной формулы инулина использовали метод етилирования с последующей деполимеризацией метилированного инулина

90% кислотой муравьиной при температуре Ю0°С в течение. 1ч и гидролизом полученных формиатов 2М кислотой трифторуксусной (100°С, 2ч). Полноту метилирования конролировали с помощью ИК-Фурье спектрометра Scimitar FTS 2000 (Австралия) в таблетках с КВг в диапазоне волновых чисел 4000-400 см"1. По данным ГЖХ/МС анализа ацетатов полиолов в стандартизируемом инулине линейная цепь имеет вид: P-D-Frcr(2[—> lyp-D-FrC/-^],,—»1-a-D-Glc^, п=25 (табл. 4).

Таблица 4 - Результаты метилирования инулина клубней георгины простой

Положение метпльиых групп Связь

3,4,6-О-Мез- Frc/ l,3,4,6-0-Me4-Frc/ 2,3,4,6-0-Me4-Glcp -<■ 1)- Frc/-(2—> Frc/(2—» Glcp-(1

Высокоэффективной анионообменной хроматографией с импульсным амперометрическим детектированием (HPAEC-PAD) с использованием хроматографа Dionex серии 4000 ion Chromatograph установлено, что средняя степень полимеризации и молекулярная масса инулина соответственно равны DP 25-30 и 5200 Da, что коррелирует с данными литературы.

Рисунок 2 - HPAEC-PAD анализ инулина, полученного из клубней георгины простой

Обзорные ИК-спектры высокоочищенного инулина измеряли на ИК-Фурье спектрометре Scimitar FTS 2000 (Австралия) в таблетках с КВг в диапазоне волновых чисел 4000-400см"' (рис. 3).

Методом ИК-Фурье-спектрометрии установлено, что в области 3424-3416 см"' наблюдается полоса поглощения, обусловленная валентными колебаниями гидроксильных групп; сильная полоса поглощения в области 2850-2960 см"' соответствуют валентным колебаниям С-Н связи; полосы поглощения в области 1200-1000 см"' соответствуют валентным колебаниям С-О связей; полосы поглощения при 820, 860 и 940 см"1 характерны для 2—>1 -связи фруктофуранозных остатков.

4000 3S00 - ЭССО -2500 , 2000 1750 ' 1600 1250 1000 760 500 l/cm

Рисунок 3 - ИК-спектр высокоочищенного инулина, полученного из клубней георгины простой Изучение химического состава клубней георгины простой Аминокислоты Полный аминокислотный состав клубней георгины простой устанавливали при помощи аминокислотного анализатора марки Amino Acid Analyzer 33 (Microtecha, Чехия) в стандартных условиях, обычно используемых для разделения белковых гидролизатов. Аминокислотный состав представлен 14 аминокислотами (кислота аспарагиновая, треонин, серии, кислота глутаминовая, глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, гистидин, лизин, аргинин), 6 из которых являются незаменимыми. Сумма незаменимых аминокислот составляет 7,1мг%, сумма

всех аминокислот - свободных и образующихся в ходе кислотного гидролиза -13,15мг%, что отражает биологическую ценность объекта исследования.

Количественное определение свободных аминокислот в клубнях георгины простой спектрофотометрическим методом показало, что их содержание в сырье составляет 2,42±0,07%.

Белки Количественное определение белка в сырье проводили по методу Лоури в модификации Миллера. Общее содержание белка в сырье составляет 10,02±0,17%.

Углеводы Из клубней георгины простой были получены водорастворимые полисахариды (ВРПС), пектиновые вещества (ПВ), гемицеллюлоза А (ГЦ А) и гемицеллюлоза Б (ГЦ Б). Выход ВРПС составляет 11,2±0,01%, ПВ - 4,0±0,003%, ГЦ А - 2,01±0,002%, ГЦ Б - 0,52±0,001% от воздушно-сухого сырья.

Методом хромато-масс-спектрометрии триметилсилильных (ТМС) производных определён качественный и количественный состав ВРПС (Glc 21,5%, Frc 64,7%), ПВ (GalA 77%, Ara 3,6%, Gal 5,2%, Rha 2,4%, Glc 1,8%, Xyl 0,8%), ГЦ A (Ara 3,3%, Gal 4,1%, Glc 8,6%) и ГЦ Б (Ara 2,7%, Gal 3,5%, Glc 8,2%). ПВ характеризуются высоким содержанием остатков кислоты галаюуроновой (77%) со степенью метоксилирования (DM) 11%.

Таблица 5 - Компонентный состав триметилсилилированного гидролизата полисахаридов клубней георгины простой по результатам ГЖХ/МС

Время удерживания, мин Сипильные производные стандартных образцов Углевод соответствугощн й стандартному образцу или его производное Время удерживания силилирован- ных компонентов полисахаридов Углевод соответствующий компоненту или его производное

15.5015.60 2,3,4,5-тетракис-О-(триметилсилил)-Ь-арабиноза L-арабиноза 15.57 - L-арабиноза

15.6615.69 6-дезокси-2,3,4,5-тетракис-0- ' (трнметилсилилУЬ-манноза L-рамноза 15.70 "' L-рамноза

16.5316.65 2,3,4,5-тетракис-О-(триметилсилилНЭ-кснлоза D-ксилоза 16.62 D-ксилоза

Продолжение таблицы 5

18.23 2,3,4,5,6-пе1Гпш1с-0- (трн м ел ш с ил 1 ш)- О-гал а п оза О-галактоза 18.26 О-галактоза

18.5018.52 2,3,4,5,6-пентакнс-О (три меп ш с ил 1 ш)- О-гл ю коза О-глюкоза 18.60 О-глюкоза

19.1519.18 1,3,4,5,6-пеитакис-О-(триметилсилшО-О-фруктоза О-фруктоза 19.16 О-фруктоза

19.4419.56 2,3,4,5-тетракис-О-(триметилсилилУО-галактуроиовой кислоты триметилсилиловый эфир О- галактуроновая кислота 19.45 О-галактуроповая кислота

Для очистки полученных ПВ от сопутствующих примесей (белка и фенольных соединений) и разделения фракций по величине их молекулярных масс был использован метод гельфильтрации на сефакриле 8-500, который позволил получить две фракции Г1В-1 (молекулярная масса 10015 Оа) и ПВ-2 (молекулярная масса 13020 Ба); содержание в них нейтральных полисахаридов и уронидной составляющей различно.

Методом ионообменной хроматографии на ОЕАЕ-целлюлозе с использованием водных растворов натрия хлорида возрастающей концентрации также были получены две фракции пектинов, которые элюировались 0,2М (ПВ-1) и 0,ЗМ (ПВ-2) растворами натрия хлорида (табл. 6). Таблица 6 - Характеристика пектиновых веществ клубней георгины простой

Фракция Выход, %* г I20 Мо Мол. Содержание, %

масса Оа1Л А га ва! КЬа Ху1 в1с Белок

Метод гельфильтрации на сефакриле 8-500

ПВ-1 31 +144 10015 57 1,6 6,4 1,5 2,3 2,1

ПС-2 67 +198,2 13020 78,4 3,6 • 4,6 2,7 0,7 ■ 1,5 3,3

Метод ионообменной хроматографии на ИЕЛЕ-г/еллюлозе

ПВ-1 33. +173 ■ ' 61 1,8 5,6 1,6 0,1 2,1 2,3

ПВ-2 65 +189 . ■ 77 3,3 4,8 2,4 0,7 1,4 3 .

Примечание - * - выход от количества материала, нанесённого на колонку

Метилирование с последующим ГЖХ/МС определением ТМС производных позволило установить последовательность расположения

нейтральных моносахаридов в молекуле пектина: —>5)-Ага/-(1—>, Ху1-(1—>, —>4)-Ху1-(1—01с/?-(1—>, -^4)-С1с-(1->, —> 6)-Са1/з-( 1 —

Таблица 7 - Результаты метилирования фракций пектинов клубней георгины простой

Положение метнльных групп Связь

2,3,6-0-Ме3-С1ср 4)-С1с -(1—

Органические кислоты Органические кислоты в исследуемом сырье идентифицировали методами бумажной хроматографии и с помощью ВЭЖХ-анализа. Обнаружены бензойная, лимонная, яблочная, янтарная, фумаровая кислоты.

Количественное определение суммы органических кислот осуществляли алкалиметрически: общая кислотность в пересчёте на кислоту яблочную составляет 0,20±0,002%.

Полшренольные соединения Методом ВЭЖХ-анализа спиртовых и водно-спиртовых извлечений из клубней георгины простой идентифицированы кумарин, умбеллиферон, эскулетин; п-кумаровая, коричная, кофейная кислоты; пирокатехин; катехин.

Содержание суммы фенольных соединений (4,50±0,21%) определяли перманганатометрическим методом, кумаринов • (1,17±0,03%) -спектрофотометрическим, дубильных веществ (3,24±0,14%) - методом Лсвентапя-Курсанова (по разнице титрования суммы фенольных соединений до и после удаления свободных фенолов и фенолокислот, переходящих в эфирное извлечение).

Количественное определение инулина Содержание инулина в клубнях георгины простой, определённое по спектрофотометрической методике,

составляет 24,03-34,38% инулина в пересчёте на фруктозу и абсолютно сухое сырьё.

Таблица 8 - Валидационные характеристики методики количественного определения инулина в клубнях георгины простой

Валидациоииыс характеристики Значение показателя

Линейность: диапазон линейности, мкг/ мл уравнение линейности Прегрвионность ЯБО, % Правильность И, % Б Б, % КБО, % 1табл. ^п.чсч 4-18 у=0,038х-0,019 2,1% 101,68 2,96 2,91 2,31 2,13

Исследование гипогликемического действия ипулипсодержащих объектов

В условиях экспериментального сахарного диабета изучены полученные инулин высокоочищенный ИБО (содержание действующего вещества не менее 95%) и порошок измельчённых воздушно-сухих клубней георгины простой ПКГ (содержащий инулина 24,03-34,3 8%).

Предварительно проводилось изучение гипогликемической активности объектов исследования при моделировании сахарной нагрузки у животных без патологии. Экспериментально установлено, что внутрижелудочное введение инулинсодержащих объектов существенным образом ограничивало гипергликемическую реакцию на введение раствора глюкозы экспериментальным животным.

Таблица 9 - Предварительное глюкозурическое действие объектов исследования (в % относительно контроля)

Группы животных Исход 30 мин 60 мин 120 мин

абелнач. (ммоль/л) абелнач. (шшль/л) % абелнач. (ммоль/л) % абелнач. (Ммоль/л) %

Контроль 6,6±0,4 8,4±0,8 +26,6 10,1±0,5 +54,9 9,2±0,5 +39,4

ИВО 5,7±0,6 6,9±0,7 +21,0 7,7±0,3 +35,1 7,1±0,6 +24,6

ПКГ 5,6±0,5 6,5±0,4 +16,1 7,2±0,6 +28,6 6,9±0,4 +23,5

«Долголет» 6,2±0,4 7,5±0,6 +21,0 8,0±0,5 +30,6 8,0±0,5 +29,0

Изучение влияния объектов исследования на концентрацию метаболитов глюкозы позволило выявить, что ПКГ более эффективно, чем «Долголет» и ИВО ограничивает лактат-ацидоз при сахарном диабете.

Установлено также, что «Долголет» и ИВО эффективно ограничивают накопление пирувата в крови, в то время как ПКГ не оказывает значимого влияния на концентрацию пировиноградной кислоты у животных с сахарным диабетом (табл. ] 0).

Таблица 10 - Влияние на углеводный обмен на фоне экспериментального сахарного диабета объектов исследования (в % относительно контроля)

Группы животных Глюкоза ¡Молочная кислота Пировнпогралоая кислота

абс.знач. (ммоль/д) % абс.знач. (ммоль/л) % абс.знач. (ммоль/л) %

Контроль 11,7±0,3* 100 0,98±0,01 100 0,16±0,001 100

ИВО 7,9±0,3*х 67,5 *х 0,82±0,01*х 83,6* 0,12±0,001*х "75,0*х

ПКГ 8,2±0,3*х 70,0*х 0,71±0,01*х 72,4* 0,15±0,001*х 93,0*х

«Долголет» 8,9±0,2* 76,0* 0,84±0,01* 85,7* 0,13±0,001* 81,3*

Примечание - обозначены статистически значимые изменения (Р<0,05) по сравнению: * - с контрольной группой животных, х - с животными, получавшими «Долголет»

Таким образом, исследуемые инулинсодержащие объекты могут быть рекомендованы в качестве потенциальных гипогликемических средств, а также средств, корректирующих нарушения липидного и белкового обмена, вызванных сахарным диабетом.

1. В качестве альтернативного топинамбуру источника инулина предложены клубни георгины простой, собранные в фазу, плодоношения на втором году жизни растения. Разработаны оптимальные методики получения и очистки инулина из свежего и сухого сырья, а также из сока клубней георгин (содержание инулина составляет от 19 до 22% в пересчёте на сухое сырьё).

Выделены и идентифнцированы три полиморфные формы инулина: а, р- и у-ннулины, отличающиеся по внешнему виду и растворимости в воде.

2. Полученный высокоочищенпый инулин должен соответствовать следующим показателям: содержание действующего вещества 95,23±1,40%, а связанной глюкозы 4,33±0,07%.

3. Методом ВЭЖХ установлено содержание низкомолекулярных компонентов инулина, а именно, глюкозы <0,1%, сахарозы 0,6%, олигомеров с DP2 2,8%, DP3 4,7%, DP5 10,5%.

Хромато-масс-спектрометрически определены нейтральные сахара и олигомеры с DP меньше 17 (глюкоза <0,1%, сахароза 0,3%, F2 2,4%, F3 4,6%, F4 5,8%, F5 9,8%, F6 9,1%, F7 11,1%, F8 15,1%, F9 12,9%, F10 15,5%).

Высокоэффективной анионообменной хроматографией с импульсным амперометрическим детектированием установлено, что средняя степень полимеризации и молекулярная масса инулина, полученного из клубней георгины простой, соответственно равны DP 25-30 и 5200 Da.

Методом метилирования с последующим формолизом и хромато-масс-спектометрическим детектированием ацетатов полиолов установлена структурная формула инулина: p-D-Frcy-(2[—>l)-p-D-Frc/-(2]n-+l-a-D-Glc/„ n=25.

4. Определены качественные и количественные характеристики биологически активных веществ клубней георгины простой и установлено, что содержание инулина составляет 24,03-34,38%, свободных аминокислот -2,42±0,07%, общего белка - 10,02±0,17%, свободных органических кислот -0,2±0,002%, кумаринов - 1,17±0,03%, дубильных веществ - 3,24±0,14%, водорастворимой фракции полисахаридов - 11,2±0,01%, пектиновых веществ -4,0±0,003%, гемицеллюлозы А - 2,01±0,002% и гемицеллюлозы Б -0,52±0,001%.

5. Методом хромато-масс-спектрометрии триметилсилильных производных определён качественный и количественный состав водорастворимых полисахаридов (ВРПС) (Glc 21,5%, Frc 64,7%), пектиновых веществ (ПВ) (GalA 77%, Ara 3,6%, Gai 5,2%, Rha 2,4%, Glc 1,8%, Xyl 0,8%),

гемицеллюлозы А (ГЦ A) (Ara 3,3%, Gal 4,1%, Glc 8,6%) и гемицеллюлозы Б (ГЦ Б) (Ara 2,7%, Gal 3,5%, Glc 8,2%).

6. Ионообменной хроматографией на DEAE-целлюлозе и гельфильтрацией на сефакриле S-500 осуществлены очистка и разделение полидисперсных пектиновых веществ на две фракции (ПВ-1 и ПВ-2), отличающиеся по содержанию в них нейтральных полисахаридов и уронидной составляющей (ПВ-1: GalA 57%, Ara 1,6%, Gal 6,4%, Rha 1,5%, Glc 2,3%; ПВ-2: GalA 78,4%, Ara 3,6%, Gal 4,6%, Rha 2,7%, Glc 1,5%, Xyl 0,7%), молекулярной массе (ПВ-1 10015Da, ¡¡B-2 13020Da) и величине удельного вращения (ПВ-1 +144°, ПВ-2 +198,2°).

7. Методом метилирования с последующим хромато-масс-спектрометрическим определением ацетатов полиолов установлена последовательность расположения нейтральных моносахаридов в молекуле пектина: -*5)-Ara/-(l->, Xyl-(1—>, ->4)-Xyl-(l->, Glcp-(l

8. Изучение эффективности действия порошка измельчённых клубней георгины простой и высокоочищенного инулина, полученного из данного сырья, при экспериментальном аллоксановом сахарном диабете показывает, что изучаемые объекты лимитируют развитие основных патогенетических звеньев сахарного диабета: ограничивают гипергликемию, лактат-ацидоз, нарушение липидного обмена и развитие эндогенной интоксикации, а также предотвращают активизацию процессов ПОЛ и способствуют активизации ферментов антиоксидантной защиты, являясь, таким образом, эффективным. средством коррекции углеводного, липидного и белкового обмена при сахарном диабете.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ананьина, H.A. Полисахариды клубней георгины простой (DAHLIA SINGLE L.) / H.A. Ананьина, O.A. Андреева, Э.Т. Оганесян // Химия раст. сырья. - 2008. - № 2. - С. 135-136.

2. Физико-химические свойства пектина клубней георгины простой (Dahlia single L.) / H.A. Ананьина [и др.] // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2008.- Вып. 63.-С. 202-204.

3. Стандартизация инулина, полученного из клубней георгины простой. Изучение некоторых физико-химических свойств инулина / H.A. Ананьина [и др.] // Хим.-фармац. журн. - 2009. - Т.43, № 3. - С. 35-37.

4. Ананьина, H.A. Количественное определение инулина в клубнях георгины простой / H.A. Ананьина, O.A. Андреева, Э.Т. Оганесян. - Пятигорск: Пятигорск. ГФА, 2009. - 11 с. - Деп. в ВИНИТИ РАН 29.01.09, № 55-В2009.

5. Ананьина, H.A. Перспективы применения инулина в фармации и пищевой промышленности / H.A. Ананьина. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009. -11 е.-Деп. в ВИНИТИ РАН 29.01.09, № 54-В2009.

6. Ананьина, H.A. Аминокислотный и микроэлементный анализ клубней георгины простой / H.A. Ананьина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009. - Вып. 64. - С.8-10.

7. Ананьина, H.A. Исследование дубильных веществ клубней георгины простой / H.A. Ананьина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2010. - Вып. 65. - С.7-8.

8. Ананьина, H.A. Изучение фенольного состава клубней георгины простой (Dahlia single L.) / H.A. Ананьина, O.A. Андреева, Э.Т. Оганесян. -Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2010. - 6 с. - Деп. в ВИНИТИ РАН 24.02.10, № 101-В2010.

АНАНЬИНА НИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КЛУБНЕЙ ГЕОРГИНЫ ПРОСТОЙ КАК АЛЬТЕРНАТИВНОГО ИСТОЧНИКА ПОЛУЧЕНИЯ ИНУЛИНА

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати «11» января 2011 г. Формат 60x84 1/16 Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печат. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № _

Государственное образовательное . учреждение высшего профессионального образования . «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, И)

Оглавление диссертации Ананьина, Нина Александровна :: 2011 :: Пятигорск

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 «Нерастворимое пищевое волокно» инулин. Характеристика. Особенности химического строения. Источники получения.

1.2 Фармакологическая активность инулина. Перспективы применения биологически активных добавок и пищевых продуктов, содержащих инулин.

Выводы по обзору литературы.

ГЛАВА 2 ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА КЛУБНЕЙ ГЕОРГИНЫ ПРОСТОЙ (DAHLIA SINGLE L.).

2.1 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

2.1.3 Макро- и микроэлементный состав.

2.1.5 Органические кислоты.

2.1.7 Полифенольные соединения.

2.1.7.1 ВЭЖХ-анализ спиртовых и водно-спиртовых извлечений клубней георгины простой.

2.1.7.3 Фенолкарбоновые кислоты.

2.1.7.4 Дубильные вещества.

2.2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.2.1 Определение товароведческих показателей сырья.

2.2.4 Макро- и микроэлементный состав.

2.2.6 Органические кислоты.

2.2.7 Полифенольные соединения.

Выводы по главе 2.

ГЛАВА 3 ПОЛУЧЕНИЕ ИНУЛИНА ИЗ КЛУБНЕЙ ГЕОРГИНЫ ПРОСТОЙ. СТАНДАРТИЗАЦИЯ ПОЛУЧЕННОГО ИНУЛИНА.

3.1 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1.1 Обоснование выбора георгины простой (Dahlia single L.) в качестве инулинсодержащего сырья.

3.1.2 Разработка методики получения и очистки инулина из клубней георгины простой.

3.1.3 Определение показателей качества высокоочищенного инулина, полученного из клубней георгины простой.

3.2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.2.1 Определение показателей качества высокоочищенного инулина, полученного из клубней георгины простой.

Выводы по главе 3.

ГЛАВА 4 КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ИНУЛИНА ИЗ КЛУБНЕЙ ГЕОРГИНЫ ПРОСТОЙ.

3.1 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1.1 Качественное определение инулина в клубнях георгины простой.

4.1.2 Усовершенствование методики количественного определения инулина в клубнях георгины простой.

4.1.3 Валидация методики количественного определения инулина в сырье.

4.2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4.2.1 Определение инулина в клубнях георгины простой.

4.2.2 Количественное определение инулина в клубнях георгины простой.

Выводы по главе 4.

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия, фармакогнозия", Ананьина, Нина Александровна, автореферат

Актуальность проблемы. Среди эндокринных заболеваний на долю сахарного диабета приходится примерно 70%. Смертность от данного заболевания занимает третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний.

Ассортимент противодиабетических лекарственных средств для перорального применения условно подразделяют на две группы — химико-фармацевтические противодиабетические препараты и гипогликемические средства на основе лекарственных растений.

В настоящее время фитотерапия является одним из распространённых методов профилактики и лечения инсулиннезависимого сахарного диабета, в связи с чем широкое применение нашли инулинсодержащие субстанции. Инулин называют «природным инсулином». Спектр его действия достаточно разнообразен благодаря его высокой гипогликемической, гиполипидемической, гипохолестеринемической активности. Являясь препаратом выбора в фитотерапии инсулиннезависимого сахарного диабета и проявляя пребиотический эффект, он находит широкое применение за рубежом. Наряду с этим данный полисахарид является источником промышленного получения фруктозы.

В России в качестве инулинсодержащего сырья рекомендованы клубни топинамбура, однако себестоимость чистого инулина из этого сырья достаточно высока. Это объясняется тем, что помимо инулина клубни топинамбура содержат карамелеобразующие фруктозаны с более низкой молекулярной массой, из-за чего возникает ряд проблем с технологией выделения и очистки инулина.

Экспериментально установлено, что процесс получения инулина из клубней топинамбура сопровождается осмолением веществ. Всё это порождает множество проблем, связанных с необходимостью применения трудоёмких технологических процессов для выделения полисахарида, требующих значительных затрат средств и времени. В клубнях топинамбура содержится большое количество энзимов, которые способствуют деполимеризации инулина, а изомеразы вызывают процесс эпимеризации фруктозы. Именно из-за наличия данных ферментов измельчённые клубни топинамбура быстро темнеют (осмоляются), а инулин, полученный из данного сырья, представляет собой смолообразную субстанцию и требует многоступенчатой очистки (например, использование ионообменных смол, очистка алюминия оксидом и кальция карбонатом), что приводит к значительным потерям инулина. Возникает необходимость инактивации ферментов с помощью лиофильной сушки, денатурации органическими растворителями, воздействия высоких температур.

Альтернативным топинамбуру сырьём являются клубни отдельных видов георгин, которые используют как в США (вид Dahlia imperialis), так и в странах Европы (вид Dahlia variabilis) в качестве источника промышленного получения инулина. Стоимость инулина, полученного из клубней георгин, варьирует в пределах 2-5 € за 1г в зависимости от степени чистоты.

Исходя из вышеизложенного, мы считаем, что поиск оптимальных путей получения инулина из альтернативного инулинсодержащего сырья -других видов клубней георгин, а также изучение возможности применения самих клубней георгин в фитотерапии инсулиннезависимого сахарного диабета является актуальным вопросом.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является экспериментальное обоснование целесообразности применения клубней георгины простой в качестве альтернативного топинамбуру инулинсодержащего источника, а также разработка оптимальных способов получения и очистки инулина из данного сырья.

Для реализации поставленной цели мы сочли необходимым решение следующих задач:

- разработать оптимальные условия выделения инулина;

- провести химическое исследование клубней георгины простой на присутствие основных групп БАВ и разработать методику количественного определения инулина в сырье; изучить влияние высокоочищенного инулина и порошка измельчённых клубней георгины простой на углеводный обмен при экспериментальном сахарном диабете.

Научная новизна. Предложен технологически доступный метод получения полиморфных форм инулина (а-, [3-, у-инулин) из клубней георгины простой, как альтернативного инулинсо держащего сырья. Разработаны оптимальные условия выделения инулина из свежего сырья, сока клубней георгин, а также сухого сырья, более устойчивого к хранению.

Для полученного нами высокоочищенного инулина определены числовые показатели качества, соответствующие требованиям зарубежного стандарта Official Monographs «Inulin» (The United States Pharmacopoeia, XXII).

Усовершенствована и валидирована методика количественного определения инулина в клубнях георгины простой.

Проведено химическое изучение клубней георгины простой, позволившее качественно и количественно охарактеризовать такие биологически активные соединения, как полисахариды, аминокислоты, макро- и микроэлементы, органические кислоты, фенольные соединения.

В ходе фармакологических исследований на модели экспериментального сахарного диабета установлено, что высокоочищенный инулин, а также порошок измельчённых клубней георгины простой существенно понижают уровень глюкозы в крови при моделировании сахарной нагрузки, лимитируют развитие основных патогенетических звеньев сахарного диабета - ограничивают гипергликемию, лактат-ацидоз, а также предотвращают активизацию процессов перекисного окисления липидов, способствуют активизации каталазы — фермента антиоксидантной защиты. Полученные данные свидетельствуют о том, что высокоочищенный инулин, а также порошок измельчённых клубней георгины простой могут быть рекомендованы для профилактики и комплексного лечения инсулиннезависимого сахарного диабета.

Практическая значимость работы. На основании проведённых экспериментальных исследований доказана целесообразность применения клубней георгины простой в качестве альтернативного топинамбуру источника инулина.

Изучение фармакологической активности инулина, полученного из клубней георгины простой, а также порошка измельчённых клубней георгины простой позволяет рекомендовать их для дальнейших углублённых исследований гипогликемической, гиполипидемической, гипохолестеринемической активности.

Внедрение результатов в практику. По материалам диссертации составлено информационное письмо «Обоснование применения высокоочищенного инулина из клубней георгины простой для коррекции экспериментального инсулиннезависимого сахарного диабета», которое передано в НИИ питания РАМН для дальнейших возможных совместных исследований, о чём имеется соответствующий акт внедрения.

Положения, выдвигаемые на защиту:

- результаты химического исследования основных групп БАВ клубней георгины простой;

- обоснование использования клубней георгины простой в качестве источника получения инулина;

- разработка методики получения полиморфных форм инулина (а-, (3-, у-инулин), стандартизация высокоочищенного инулина;

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Пятигорской государственной фармацевтической академии Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию», а также в соответствии с соглашением о выполнении НИР между Федеральным агенством по здравоохранению и социальному развитию и ГОУ ВПО «Пятигорской государственной фармацевтической академией Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию» (№ государственной регистрации 01200411089).

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 129 страницах текста компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы и 3 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 155 источников, в том числе 70 иностранных, приложения; содержит 52 таблицы, 20 рисунков и приложения.

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎