Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему: Стандартизация травы фиалки и экстракта сухого, полученного на ее основе
Автореферат диссертации по фармакологии на тему Стандартизация травы фиалки и экстракта сухого, полученного на ее основе
На правах рукописи
СМИРНОВА МАРИНА МИРОНОВНА
СТАНДАРТИЗАЦИЯ ТРАВЫ ФИАЛКИ И ЭКСТРАКТА СУХОГО, ПОЛУЧЕННОГО НА ЕЕ ОСНОВЕ
15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Работа выполнена в Государственном общеобразовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения России».
Кандидат фармацевтических наук, профессор Олешко Григорий Иванович. ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
Доктор фармацевтических наук, профессор Фурса Николай Сергеевич. Кандидат фармацевтических наук, доцент Эвич Нина Ивановна.
Государственное общеобразовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Минздрава России».
Защита состоится » сентября 2004 г.
в /3 часов на заседании Диссертационного совета Д 280.068.01 при ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Минздрава России» по адресу: 614990, Пермь, ул. Ленина, 48.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «ПГФА Минздрава России»
Автореферат разослан «_» ^¿/¿¿уу-^^ 2004 г.
Диссертационного совета Д 208.068.01, канд. фармац. наук, доцент
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. К числу важнейших задач медицинской и фармацевтической науки относится изыскание эффективных лекарственных средств на основе природных биологически активных веществ (БАВ). В пользу последних особенно убедительно говорят низкая токсичность и ограниченный спектр побочных явлений, что выгодно отличает их от синтетических препаратов. Поэтому не случайно в настоящее время из лекарственного растительного сырья (ЛРС) получают одну треть всех разрешенных к применению лекарственных средств [Лекарственные растения Государственной фармакопеи, 1999].
Перспективным источником для получения фитопрепаратов является трава фиалки (Herba Violae), которая признана официнальным видом сырья и заготавливается от двух производящих растений: фиалки трехцветной — Viola tricolor L. и фиалки полевой -Viola arvensis Murr. Химический состав данных видов представлен различными группами БАВ, обуславливающих противовоспалительное, отхаркивающее, ранозаживляющее, противоотечное, капилляро-укрепляющее, противоязвенное действие [Соколов, Замотаев, 1990, Бубенчиков, 2002].
В настоящее время трава фиалки применяется в виде одной лекарственной формы - настоя, имеющей ряд существенных недостатков (неточность дозирования, ограниченный срок хранения, неудобство транспортировки). С учетом данных о химическом составе и биологической активности применение травы фиалки в медицинской практике является явно недостаточным и поэтому важное значение имеет создание на ее основе рациональной лекарственной формы - сухого экстракта, позволяющего расширить ассортимент лекарственных форм из растительного сырья, упростить процедуру их применения.
По литературным данным известно, что основными группами БАВ, обеспечивающих фармакологический эффект травы фиалки, являются полисахариды и флавоноиды. Однако в соответствии с ГФ XI издания оценка качества сырья проводится по содержанию экстрактивных веществ, извлекаемых водой,
что не позволяет объективно оценивать качество сырья и не обеспечивает контроль за сохранением его фармакологической активности на протяжении всего срока хранения. Вышеизложенное указывает на актуальность создания новых лекарственных средств на основе травы фиалки, а также разработки методик «сквозной стандартизации» лекарственного растительного сырья и препарата, по группам действующих веществ.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящего исследования является разработка методик стандартизации травы фиалки по группам БАВ, получение фиалки экстракта сухого и его стандартизация.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
- провести аналитический обзор литературы по фитохимическим и фармакологическим исследованиям травы фиалки;
- исследовать химический состав травы фиалки и полученного из нее экстракта сухого на наличие БАВ;
- разработать методики качественного и количественного анализа доминирующих групп БАВ в траве и фиалки экстракте сухом;
- разработать показатели качества для травы фиалки по содержанию БАВ;
- изучить оптимальные условия экстракции БАВ травы фиалки и разработать способ получения фиалки экстракта сухого;
- провести стандартизацию полученной лекарственной формы по содержанию основных групп БАВ, технологическим, физико-химическим, микробиологическим показателям;
- установить оптимальные условия и сроки хранения фиалки экстракта сухого;
- изучить острую токсичность и фармакологическую активность фиалки экстракта сухого;
- разработать проект ФСП на траву фиалки, лабораторный технологический регламент и проект ФСП на фиалки экстракт сухой.
Разработаны показатели качества травы фиалки по сумме флавоноидов в пересчете на рутин и по сумме полисахаридов.
Впервые изучено содержание суммы флавоноидов и полисахаридов в течение срока годности сырья.
Предложено включить в проект ФСП для подтверждения подлинности сырья проведение качественных реакций на флавоноиды и полисахариды и установление максимума поглощения комплекса суммы флавоноидов с алюминия хлоридом.
Впервые проведено количественное определение суммы антоцианов в траве фиалки трехцветной.
Впервые разработана методика количественного определения аскорбиновой кислоты в траве фиалки трехцветной и фиалки полевой.
Впервые экспериментально подобраны экстрагент и условия выделения комплекса БАВ из травы фиалки. Выбранные оптимальные параметры экстракции легли в основу способа получения фиалки экстракта сухого. Изучен химический состав, показатели качества и стабильность фиалки экстракта сухого, разработаны методики его стандартизации. Проведено исследование острой токсичности и фармакологической активности фиалки экстракта сухого. Определены условия и сроки хранения.
На основе комплексного подхода разработаны унифицированные методики «сквозной стандартизации» травы фиалки и фиалки экстракта сухого. Ре-
зультаты исследования включены в проекты ФСП на траву фиалки и фиалки экстракт сухой.
Разработан способ получения фиалки экстракта сухого. Результаты технологических исследований использованы для разработки лабораторного технологического регламента, прошедшего апробацию на ОАО «Биохиммаш» г. Москва.
Результаты исследований используются в учебном процессе:
- на кафедре фармакогнозии ГОУ ВПО «ПГФА Минздрава России» при изучении теоретического и практического материала на 3 курсе очного факультета, на занятиях интернов, слушателей элективных курсов, факультета дополнительного профессионального образования (акт от 9.06.2004);
- на кафедре фармацевтической технологии ГОУ ВПО «ПГФА Минздрава России» при изучении теоретического и практического материала на 3 курсе очного факультета, 5 курсе заочного факультета и в интернатуре (акт от 23.01.2003).
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:
- Межвузовской научно-практической конференции, посвященной 85-летию высшего образования на Урале (Пермь, 2001);
- Третьей международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2002);
- IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002);
- VI Международном съезде «Актуальные проблемы создания препаратов природного происхождения» (С- Петербург, 2002);
- Областной научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Молодежная наука Прикамья - 2002» (Пермь, 2002);
- IV Международном конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2003);
- Межвузовской научно-практической . конференции профессорско-преподавательского состава «Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы» (Пермь, 2003);
- Российской научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств» (Пермь, 2004);
- XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических
Диссертационная работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия Минздрава России» в соответствии с планом научно-исследовательских работ по теме «Изучение лекарственной флоры РФ» (номер Государственной регистрации 01.9.10.018875). Тема утверждена на заседании Ученого совета Пермской государственной фармацевтической академии (протокол № 4 от 27.12.01).
Положения, выдвигаемые на защиту:
- Результаты изучения качественного химического анализа и количественного определения БАВ в траве фиалки трехцветной и фиалки полевой;
- Результаты исследования содержания суммы флавоноидов и полисахаридов в течение срока годности и обоснование показателей и норм качества травы фиалки.
- Результаты изучения оптимальных условий экстрагирования с целью получения фиалки экстракта сухого;
- Результаты стандартизации травы и полученной субстанции по основным показателям качества.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста, иллюстрирована 13 рисунками, 35 таблицами и состоит из введения, обзора литературы, трех глав, посвященных экспериментальным исследованиям, выводов, списка литературы и приложения. Библиографический указатель включает 238 источников, в том числе 31 иностранных авторов.
Во введении обоснована и сформулирована актуальность темы, цели и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы.
В первой главе представлен обзор литературы по химическому составу и применению травы фиалки, фармакологической активности преобладающих групп БАВ. Показана целесообразность использования изучаемого вида сырья для создания лекарственных препаратов.
Вторая глава включает сведения об объектах и методах исследования, использованных в работе.
В третьей главе приведены результаты качественного химического анализа и количественного определения БАВ (флавоноидов, антоцианов, полисахаридов, аскорбиновой кислоты, аминокислот и микроэлементов), исследования содержания суммы флавоноидов и полисахаридов в течение срока хранения и обоснование показателей и норм качества травы фиалки.
В четвертой главе содержатся данные по установлению оптимальных условий экстрагирования травы фиалки, получению фиалки экстракта сухого, по изучению основных показателей качества, фармакологического действия, условий и сроков хранения полученного препарата.
В Приложение включены проекты ФСП «Трава фиалки» и «Фиалки экстракт сухой», лабораторный регламент получения фиалки экстракта сухого, акты апробации и внедрения.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования
Объектами исследования служили образцы травы фиалки трехцветной (Viola tricolor L.) и фиалки полевой (Viola arvensis Murr), заготовленные на территории региона Урала; образцы промышленных производителей (АО «Крас-ногорсклексредства», ОАО «Здоровье», АО «Лектравы»). Отбор проб проводили в соответствии с ГФ XI изд. Для проведения анализа готовили настой по ГФ XI издания в соотношении 1:10.
Для идентификации в сырье основных групп БАВ применяли известные качественные реакции и хроматографические исследования. Хроматографиче-ские исследования проводили методами восходящей хроматографии на бумаге (ВБХ), хроматографии в тонком слое.
Для проведения анализа методом ВБХ использовали хроматографиче-скую бумагу марки «С» производства фабрики им. Володарского (Санкт-Петербург) и следующие системы растворителей: бутанол - уксусная кислота -вода (4:1:5) и уксусная кислота - вода (15:85), хлористоводородная кислота -вода (1:99). Хроматографию в тонком слое проводили на пластинках «Silufol» и «Sorbfil» с использованием систем: бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5), хлористоводородная кислота — вода (1:99), хлористоводородная кислота - вода (3:97) и 95% этиловый спирт - конц. аммиак (16:4,5).
Для проведения анализа использовали реактивы, растворители и стандартные вещества, соответствующие требованиям НД. В качестве стандартов применяли ГСО рутина (ФС 42-2508-87), ГСО кверцетина (ФС 42-1290-79)
Количественное определение основных групп БАВ осуществляли, используя общепринятые методики, регламентированные частными статьями ГФ XI изд.
Изучение микроэлементного состава травы фиалки и фиалки экстракта сухого проводили с помощью дифракционного спектрографа ДФС-13-1 мето-
дом зтомно-абсорбционной спектроскопии в аналитическом центре ОАО «Уральская центральная лаборатория» (г. Екатеринбург).
Товароведческие показатели определяли в соответствии с требованиями ГФ XI издания и ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества лекарственных средств».
Фиалки экстракт сухой получали на ОАО «Биохиммаш» по разработанной нами технологии из сырья травы фиалки.
Изучение показателей качества фиалки экстракта сухого проводили в соответствии с требованиями общей статьи «Экстракты» ГФ XI, вып. 2, с. 160.
Микробиологические исследования проводили на кафедре микробиологии ПГФА (зав. кафедрой доцент Одегова Т.Ф.) по статье ГФ XI, вып. 2 и Изменениям № 3 от 19.06.2003 к статье ГФ XI «Методы микробиологического контроля лекарственных средств».
С целью определения фармакологической активности фиалки экстракта сухого использовали наиболее адекватные модели и информативные методики.
Изучение противовоспалительных и ранозаживляющих свойств фиалки экстракта сухого проводили на кафедре физиологии с основами анатомии ПГФА (зав. кафедрой профессор Сыропятов Б Л.). Опыты проводили на белых беспородных крысах обоего пола массой 260 - 320 г. Эксперименты осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием лабораторных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.77). Противовоспалительную активность изучали на модели острого каррагенинового отека. Фиалки экстракт сухой использовали в виде 0,0003 % водного раствора, который вводили через зонд в желудок из расчета 1 мл на 100 г массы животного. Животные контрольной группы получали физиологический раствор (Саля-мон, 1951).
Изучение ранозаживляющей активности экстракта проводили на модели линейной кожной раны. Для обработки ран исследуемой группы животных
применяли 1% водный раствор фиалки экстракта сухого, контрольной группы -дистиллированную воду (Мишарев, 1984).
Изучение острой токсичности исследуемого препарата проводили в лаборатории токсикологии ВИЛАР в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000). Фиалки экстракт сухой вводили в виде 5-25 % водных растворов в объемах 0,2-10 мл на животное (Беленький, 1963).
Статистическую обработку экспериментальных данных (р = 95 %) проводили при помощи критерия Стьюдента по методике ГФ XI.
Изучение химического состава и стандартизация травы фиалки по основным группам БАВ
С целью обеспечения доброкачественности сырья для получения фитопрепаратов проводили качественный химический и количественный анализ БАВ травы фиалки.
В результате исследования в траве фиалки трехцветной и фиалки полевой обнаружено присутствие флавоноидов, полисахаридов, аминокислот, аскорбиновой кислоты, кроме того, в траве фиалки трехцветной — антоцианов.
Хроматографирование водно-спиртовых извлечений в системе н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5) показало наличие на хроматограммах четырех пятен веществ флавоноидной природы в траве фиалки трехцветной и трех в траве фиалки полевой. Со свидетелем идентифицированы рутин и кверцетин.
Проведение качественного анализа на наличие антоцианов показало, что положительный результат дают только извлечения из травы фиалки трехцветной. Реакции на антоцианы отрицательны для извлечений из травы фиалки полевой индивидуального сбора, а также в некоторых образцах промышленных серий, что можно объяснить двумя причинами:
- сырье заготовлено от фиалки полевой;
- сырье заготовлено от фиалки трехцветной, но не в период цветения.
Определение локализации антоцианов по органам фиалки трехцветной показало, что характерное для антоцианов малиновое окрашивание извлечения, синий аморфный осадок и яркое оливково-зеленое окрашивание, наблюдаются только у извлечения из лепестков фиалки трехцветной (таблица 1).
Результаты качественных реакций для определения локализации
Антоцианов по органам травы фиалки трехцветной
Исследуемые Результаты реакций
органы Окраска с 1 % рас- Цвет осадка с 10% Окраска с 10% рас-
растения твором хлористово- раствором ацетата твором гидроксида
дородной кислоты свинца натрия
Стебли Слабо желтая Желтый Желто-зеленая
Листья Слабо желто-зеленая Желтый Желто-зеленая
Чашелистики Слабо желто-зеленая Желтый Желто-зеленая
Лепестки Малиновая Синий аморфный Оливково-зеленая
Створки плодов Бесцветная Желтый Слабо желто-зеленая
Семена Бесцветная Желтый Слабо желтая
Проводили хроматографирование извлечений из травы фиалки трехцветной до и после кислотного гидролиза параллельно с извлечениями из цветков василька и плодов черники, т.к. согласно литературным данным в указанных видах присутствуют антоцианы (Кнышев, 1978, Панчев, 1980).
Система хлористоводородная кислота-вода (3:97) является оптимальной для разделения антоцианов до и после гидролиза. В извлечении из травы фиалки трехцветной до гидролиза обнаружили 1 пятно ЯГ = 0,38, а после кислотного гидролиза - 2 пятна ЯГ = 0,18 и 0,52 характерной малиновой флюоресценции, соответствующие по значениям ЯГ пятнам извлечений цветков василька и плодов черники, что позволяет отнести их к антоцианам.
В последнее время все чаще лекарственные растения рассматриваются как источники аминокислот. Перспективным в этом отношении является сырье травы фиалки. Исследование аминокислотного состава травы фиалки показало, что в изученных образцах травы фиалки обнаружено 11 аминокислот, 7 из них идентифицированы как аланин, аспарагиновая кислота, валин, глицин, лейцин, серии, тирозин. В результате анализа установлено, что для всех изученных об-
разцов хроматографическая картина одинакова. Это свидетельствует об идентичности аминокислотного состава фиалки трехцветной и фиалки полевой.
Количественное определение суммы флавоноидов проводили спектро-фотометрическим методом по методике, разработанной для травы фиалки трехцветной и полевой (Печерская Л.Г., 1997).
В качестве стандартного вещества использовали рутин, спектр поглощения которого с алюминия хлоридом в предлагаемых условиях совпадает со спектром поглощения комплекса флавоноидов травы фиалки (рис. 1).
Содержание суммы флавоноидов в траве фиалки значительное и составляет от 2,10 до 3,94 %. (табл. 2).
Рис. 1. Спектр поглощения комплекса флавоноидов травы фиалки и раствора ГСО рутина с алюминия хлоридом
Для количественного определения антоцианов в траве фиалки использовали спектрофотометрический метод, который включен в ГФ XI издания для цветков василька. Установлены оптимальные условия извлечения антоцианов из травы фиалки. В качестве экстрагента использовали 1 % раствор хлористоводородной кислоты, степень измельчения сырья 1 мм, соотношение сырье-
экстрагент 1:100. Сырье настаивании на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 15 минут с трехкратной сменой экстрагента. В сумме антоцианов травы фиалки содержится цианидин-3,5-диглюкозид, поэтому количественное определение антоцианов вели в пересчете на данное соединение (табл. 2).
Результаты количественного определения БАВ травы фиалки (п = 5)
№ п/п Образец сырья, дата сбора или серия Содержание
флавонои-дов, % антоцианов, мг% полисахаридов, % аскорбиновой кислоты, мг%
1 Трава фиалки трехцветной (Добрянский район Пермской области, 07.1998) 3,59 ± 0,10 80,0 ± 3,4 9,44 ± 0,21 124 ±5,5
2 Трава фиалки трехцветной (Пермская область, окрестности с. Усть-Качка, 06.2002) 3,94 ±0,19 135,0 ±4,1 8,05 ± 0,34 108 ±5,1
3 Трава фиалки полевой (Пермская область, окрестности с. Усть-Качка, 07.2000) 3,70 ±0,10 9,72 ± 0,35 133 ±3,5
4 Трава фиалки, АО «Красногорсклек-средства». Серия 90799 2,29 ± 0,08 6,58 + 0,23 62 ±4,7
5 Трава фиалки, АО «Красногорсклек-средства». Серия 60500 2,41 ±0,09 7,90 ±0,26 97 ± 2,7
6 Трава фиалки, АО «Красногорсклек-средства». Серия 30401 2,10±0,06 8,55 ±0,30 118 ±2,7
7 Трава фиалки, АО «Лектравы», Украина. Серия 20198 2,25 ± 0,07 8,92 ±0,62 100 ±4,7
8 Трава фиалки трехцветной, ОАО «Здоровье» Серия 02.08. 00 3,01 ±0,14 115,0 ±4,7 7,59 ±0,41 79 ±3,8
9 Трава фиалки трехцветной, ОАО «Здоровье» Серия 01.05.01. 2,56 ±0,04 127,0 ±5,2 7,02 ±0,29 72 ±4,0
В результате анализа определили, что содержание антоцианов в траве фиалки трехцветной от 80 до 135 мг%. Относительная ошибка метода с доверительной вероятностью 95 % составляет ±4,87 %.
Одной их важных групп, обеспечивающих фармакологический эффект травы фиалки, являются полисахариды. Количественную оценку полисахарид-ного комплекса проводили гравиметрическим методом.
Содержание полисахаридов в траве фиалки трехцветной от 7,02 до 9,44%, а для фиалки полевой - 9,72% (табл. 2). Относительная ошибка метода с доверительной вероятностью 95 % составляет ± 4,15 %.
В результате качественного анализа, проведенного с помощью химических реакций и хроматографии, установлено присутствие в траве фиалки аскорбиновой кислоты. Количественную оценку данного соединения проводили титриметрическим методом по методике ГФ XI изд., модифицированной нами для травы фиалки. Определены оптимальные условия извлечения аскорбиновой кислоты из сырья. Содержание аскорбиновой кислоты в траве фиалки находится в пределах 62 - 133 мг% (табл. 2). Относительная ошибка метода с доверительной вероятностью 95 % составляет ± 5,40 %.
Природные комплексы микроэлементов играют важную роль в физиологических процессах человеческого организма и участвуют в биогенезе действующих веществ лекарственных растений. Изучение элементного состава травы фиалки показало присутствие 20 микроэлементов, которые в зависимости от концентрации располагаются в следующей последовательности: марганец, титан, барий, стронций, цирконий, цинк, медь, никель, хром, ванадий, иттрий, ниобий, свинец, галлий, кобальт, скандий, молибден, бериллий, иттербий, серебро. Содержание токсичных элементов не превышает ПДК принятые для пищевых продуктов (Сан.ПиН2.3.2.1078-01).
Исследование микробиологической чистоты травы фиалки позволило установить, что все исследованные образцы соответствовали Изменениям № 3 от
Результаты исследования стабильности содержания
флавоноидов и .полисахаридов.в траве фиалки
^ Содержание сум- Продолжитель-
Район сбора или поставщик
Дата сбора или серия
Дата первичного анализа и переконтроля
Содержание суммы флавоноидов, _%_
Содержание суммы полисахаридов, %
Трава фиалки трехцветной
2,35 2,32 2,30 2,17
8,78 8,66 8,32 8,03
Трава фиалки трехцветной
2,66 2,63 2,58 2,44
9,02 8,81 8,26 7,94
Трава фиалки трехцветной
2,57 2,50 2,45 2,38
7,87 7,55 7,16 6,93
Трава фиалки трехцветной
3,46 3,37 3,29 3.15
9,85 9,73 9.21 8,81
Трава фиалки трехцветной
2,91 2,84 2,73 2,70
8,22 8,00 7,59 7,18
Трава фиалки трехцветной
3,29 3,24 3,19 3,01
9,58 9,44 9,01 8,74
Трава фиалхи полевой
3,07 3,02 2,98 2,85
9,96 9,77 9,31 8,92
Трава фиалки полевой
2,82 2,76 2,65 2,51
7.95 7,81 7,39 7,11
19.06.2003 к статье ГФ XI «Методы микробиологического контроля лекарственных средств» (категория 4 А).
Результаты товароведческого, качественного химического и количественного анализа, а также определение микробиологической чистоты использованы при составлении проекта ФСП «Трава фиалки». На основании данных анализа предложено включить в проект ФСП на траву фиалки показатели - содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин - не менее 1,5 % и содержание суммы полисахаридов - не менее 5 %.
Проведены исследования по подтверждению стабильности количественного содержания суммы флавоноидов и полисахаридов на протяжении срока годности, который для травы фиалки, согласно ГФ XI изд., составляет 3 года. Установлено, что в сырье фиалки как трехцветной, так и полевой, хранившемся до 3-х лет, содержание суммы флавоноидов и полисахаридов снижалось незначительно и к концу срока хранения находилось в пределах от 2,17 % до 3,15% и от 6,93 % до 8,92 % соответственно (табл. 3).
Разработка технологии и стандартизация фиалки экстракта сухого
Основными факторами, влияющими на процесс экстракции являются тип экстрагента, температура, степень измельчения сырья, соотношение сырья и экстрагента, продолжительность и кратность экстракции.
В результате исследования установлено, что наиболее оптимальным экс-трагентом является вода очищенная. Изучение температурного режима показало, что температура 90±5 °С обеспечивает наиболее полное извлечение БАВ травы фиалки. Опытным путем подобрано оптимальное соотношение фаз 1:10 (сырье-экстрагент) и степень измельчения сырья 2-5 мм. На основании проведенных исследований установлено, что трехкратная смена экстрагента обеспечивает максимальное истощение сырья, при этом равновесное состояние в системе наступает через 30 минут на каждой из ступеней экстракции.
Рис. 2. Технологическая схема получения фиалки экстракта сухого (Кт, Кх, Км - контроль технологический, химический, микробиологический, соответственно).
Способ получения экстракта отработан на ОАО «Биохиммаш» на прямоточной распылительной сушилке «№го Atomazer». Технологическая схема получения фиалки экстракта сухого представлена на рис. 2
Экстракт представляет собой гигроскопичный аморфный порошок светло-коричневого цвета, со специфическим запахом и характерным вкусом. Мало растворим в спирте, хорошо растворим в воде.
С помощью качественных реакций и хроматографии подтверждено присутствие в фиалки экстракте сухом флавоноидов, антоцианов, полисахаридов, аминокислот и аскорбиновой кислоты.
С учетом комплексного подхода к стандартизации сырья и фитопрепарата, разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов, антоцианов и полисахаридов.
В результате количественного определения БАВ пяти серий экстракта установлено, что количество флавоноидов в пересчете на рутин составляет от 3,94 до 4,55 % (относительная ошибка методики составляет ± 4,36 %), антоцианов в пересчете на цианидин - 3,5 - диглюкозид от 109 до 158 мг% (относительная ошибка методики составляет ± 4,47 %), полисахаридов от 26,89 до 34,05 % (относительная ошибка методики составляет ± 3,52 %) (табл. 4).
Установлены нормы содержания суммы флавоноидов в фиалки экстракте сухом - не менее 2 % и суммы полисахаридов - не менее 20 %. На основании полученных данных составлен проект ФСП.
В результате исследования микроэлементного состава фиалки экстракта сухого прослеживается очевидная взаимосвязь между содержанием микроэлементов в траве и экстракте, что позволило сделать вывод об эффективности способа получения экстракта.
Результаты стандартизации 5 промышленных серий фиалки экстракта сухого по показателям: внешний вид, подлинность, содержание БАВ, рН водного раствора, потеря в массе при высушивании, содержание тяжелых металлов и
Результаты стандартизации фиалки экстракта сухого
№ серии Описание: аморфный порошок светло-коричневого цвета, со специфическим запахом и вкусом Содержание флавонои-дов в пересчете на рутин, % Содержание антоцианов в пересчете нациани-дин-3,5-диглюко-зид, % Содержание полисахаридов, % Потеря в массе при высушивании, % рН водного раствора Тяжелые металлы, не более 0,01 % Микробиологическая чистота, кат. 3 Б
01 Соответствует 4,29 ± 0,07 0,122 ± 0,092 29,12 ±2,31 4,22 ± 0,30 5,36±0,10 Соответствует Соответствует
02 - «- 4,05 ± 0,02 0,115 ± 0,028 30,99 ±1,90 4,51 ±0,23 5,13+0,21 - «- - « -
03 - «- 4,55 ± 0,09 0,158 ± 0,076 26,89 ±4,01 3,90 ± 0,41 5,44±0,17 - «- - «-
04 - «- 3,94 ± 0,08 0,109 ± 0,080 34,05 ± 2,48 4,02 ± 0,29 5,31±0,11 -«- - « -
05 - «- 4,19 ±0,05 0,136 ± 0,057 32,21 ± 2,87 4,11± 0,34 5,52±0,13 - « - - «-
микробиологическая чистота, позволяют сделать вывод о том, что полученный экстракт отвечает требованиям ГФ XI изд., вып. 2 (табл. 4).
С помощью общеизвестных методик установлены технологические характеристики фиалки экстракта сухого: насыпная масса при свободном падении - 0,30 - 0,41 г/см3, насыпная масса при уплотнении 0,64 - 0,72 г/см3, сыпучесть 1,39 - 1,52 г/с, угол естественного откоса 42 - 46
При определении срока годности экстракта, проведенного методом «ускоренного старения» и естественного хранения, установлено, что фиалки экстракт сухой выдерживает хранение в течение 2 лет.
В результате изучения острой токсичности исследуемого препарата установлено, что ЛД50 ДЩ фиалки экстракта сухого при внутрибрюшинном введении белым лабораторным мышам самцам и самкам составляет 2920 ± 180 и 3200 ± 200, соответственно; крысам самцам и самкам - более 5000 мг/кг; при введении в желудок мышам и крысам обоего пола — более 15000 мг/кг.
Исследования, проведенные при однократном внутрибрюшинном и внут-рижелудочном введении различным видам лабораторных животных фиалки экстракта сухого, показали, что данный препарат является практически нетоксичным веществом (V класс токсичности, по классификации токсичности принятой в РФ и ВОЗ).
Как известно, фармакологический эффект травы фиалки обусловлен присутствием комплекса БАВ, в частности флавоноидов и полисахаридов, обладающих противовоспалительным и ранозаживляющим действием. На основании этих данных проводили исследование противовоспалительной и раноза-живляющей активности фиалки экстракта сухого.
В результате исследования противовоспалительных свойств обнаружено, что в контрольной группе прирост объема стопы составил 105,9 %, ав группах с применением раствора экстракта - 85,4% (рис. 3) Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что фиалки экстракт сухой обладает противовоспалительной активностью.
Рис 3. Результаты изучения противовоспалительной активности фиалки экстракта сухого
дуемую группу - 1 % водным раствором фиалки экстракта сухого, контрольную группу животных -водой дистиллированной,
К 5 и 7 суткам раствор экстракта достоверно увеличивал силу разрыва рубца в сравнении с контролем. Результаты исследования показали, что экстракт фиалки обладает ранозаживляющей активно-
О наличии ранозаживляю-щей активности судили по скорости течения репарации срастающихся тканей. Объективным показателем этого процесса являлась прочность послеоперационного рубца, которую определяли тензиометрически на 3, 5, 7 сутки эксперимента.
Раны опытных животных ежедневно обрабатывали: иссле-
Н Контроль О Фиалки экстракт сухой
Рис4. Результаты изучения ранозаживляющей активности фиалки экстракта сухого
1. На основании исследования химического состава травы фиалки, предложено проводить оценку качества сырья по показателям: содержание суммы фла-воноидов в пересчете на рутин - не менее 1,5 % и суммы полисахаридов — не менее 5 %.
2. Установлены оптимальные условия экстрагирования травы фиалки, сгущения и сушки полученного извлечения. Разработана технологическая схема получения фиалки экстракта сухого.
3. Разработаны методики качественного и количественного анализа экстракта по основным группам БАВ. Содержание флавоноидов в пересчете на рутин составило 3,94 - 4,55%, антоцианов в пересчете на цианидин-3,5-диглюкозид 0,109 - 0,158 % и полисахаридов 26,89 - 34,05 %.
4. Методом атомно-абсорбционной спектроскопии определен микроэлементный состав травы фиалки и экстракта сухого, представленный 20 микроэлементами, которые в зависимости от концентрации располагаются в следующей последовательности: марганец, титан, барий, стронций, цирконий, цинк, медь, никель, хром, ванадий, иттрий, ниобий, свинец, галлий, кобальт, скандий, молибден, бериллий, иттербий, серебро.
5. Изучен аминокислотный состав исследуемых объектов. По результатам анализа, полученный экстракт соответствует траве фиалки по аминокислотному составу, который представлен 11 аминокислотами, 7 из них идентифицированы как аланин, аспарагиновая кислота, валин, глицин, лейцин, серии, тирозин.
6. С учетом принципа «сквозной стандартизацию) разработаны показатели качества фиалки экстракта сухого: содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин - не менее 2 % и содержание суммы полисахаридов - не менее 20%.
7. Проведена стандартизация полученного экстракта по показателям: внешний вид, содержание суммы флавоноидов и полисахаридов, потеря в массе при высушивании, рН водного раствора, содержание тяжелых металлов, микробиологическая чистота.
8. Исследованы условия и срок годности экстракта. Рекомендуемый срок хранения 2 года при температуре не выше 20 °С и влажности воздуха в помещении 60-65%.
9. Установлена биологическая безвредность, а также противовоспалительное и ранозаживляющее действие фиалки экстракта сухого.
ЮНа основании полученных данных разработаны и приняты к рассмотрению проекты ФСП «Трава фиалки» и «Фиалки экстракт сухой», а также заявка на патент «Способ получения противовоспалительного, ранозаживляющего, капилляроукрепляющего, иммуномодулирующего средства» (приоритетная справка № 200300112/14 от 06.2003г.).
По материалам диссертации опубликованы следующие работы:
1. Смирнова М.М., Олешко Г.И., Печерская Л.Г., Блинова О.А. Исследования по разработке экстракционных препаратов из травы фиалки // Межвузовская научно-практическая конференция, посвященная 85-летию высшего образования на Урале «Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы».- Пермь, 2001. - С. 116.
2. Блинова О.А., Печерская Л.Г., Смирнова М.М, Олешко Г.И, Назаренко П.В.,Мухамеджанова Д.М. Антоцианы травы фиалки.// Фармация. -2002.-№ 4-С.16-18.
3. Олешко Г И., Блинова О.А, Мухамеджанова Д.М., Назаренко П.В., Печерская Л.Г., Смирнова М.М. Комплексная переработка травы фиалки // IX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - Москва, 2002. — С. 666-667.
4. Печерская Л.Г., Смирнова М.М., Блинова О.А., Олешко Г.И. Исследование содержания флавоноидного комплекса травы фиалки в водном извлечении и лекарственных пленках.// Третья международная научно-практическая конференция «Здоровье и образование в XXI веке». - Москва, 2001-С. 318.
5. Смирнова ММ., Блинова ОА Разработка оптимальной технологии экстракционных препаратов из травы фиалки // Областная научная конференция
молодых ученых, аспирантов и студентов «Молодежная наука Прикамья -2002». - Пермь, 2002. - С. 148.
6. Смирнова М.М., Блинова О.А. Выбор оптимальной технологии получения экстракта фиалки сухого //IV Международный конгресс молодых ученых «Науки о человеке».- Томск, 2003. - С. 221.
7. Смирнова М.М., Блинова О.А., Рудакова И.П., Олешко Г.И. Исследование противовоспалительной и ранозаживляющей активности экстракта фиалки сухого // Межвузовская научно-практическая конференция профессорско-преподавательского состава «Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы»,- Пермь, 2003. — С. 119.
8. Блинова ОА, Смирнова М.М., Олешко Г.И., Мухамеджанова Д.М. Стандартизация фиалки экстракта сухого // XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство».- Москва, 2004. - С. 765.
9. Смирнова М.М., Блинова О.А., Олешко Г.И., Мухамеджанова Д.М. Исследование микроэлементного состава травы фиалки и фиалки экстракта сухого // Российская научно-практическая конференция «Рациональные использование лекарств». - Пермь, 2004. - С. 92.