научная статья по теме ФОТОПОВРЕЖДАЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ПОЛНОСТЬЮ-ТРАНС-РЕТИНАЛЯ И ПРОДУКТОВ ЕГО ПРЕВРАЩЕНИЯ НА МОЛЕКУЛУ РОДОПСИНА В СОСТАВЕ ФОТОРЕЦЕПТОРНОЙ МЕМБРАНЫ Химия

Текст научной статьи на тему «ФОТОПОВРЕЖДАЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ПОЛНОСТЬЮ-ТРАНС-РЕТИНАЛЯ И ПРОДУКТОВ ЕГО ПРЕВРАЩЕНИЯ НА МОЛЕКУЛУ РОДОПСИНА В СОСТАВЕ ФОТОРЕЦЕПТОРНОЙ МЕМБРАНЫ»

БИОХИМИЯ, 2008, том 73, вып. 2, с. 162 — 172

ФОТОПОВРЕЖДАЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ПОЛНОСТЬЮ-ТРАНС-РЕТИНАЛЯ И ПРОДУКТОВ ЕГО ПРЕВРАЩЕНИЯ НА МОЛЕКУЛУ РОДОПСИНА В СОСТАВЕ ФОТОРЕЦЕПТОРНОЙ МЕМБРАНЫ*' **

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119334 Москва, ул. Косыгина, 4; факс: (495)137-4101, электронная почта: marina.loguinova@mail.ru

Поступила в редакцию 13.07.07 После доработки 08.10.07

Создана модельная система, содержащая А2-родопсин, ШЯ-РЕ, А2-РЕ и АТЯ-димер-РЕ, позволяющая исследовать фотосенсибилизированное повреждение родопсина в составе фоторецепторной мембраны наружного сегмента зрительной клетки — палочки. Показано, что при облучении такой системы видимым светом (400—700 нм) происходит нарушение важнейшего функционального свойства зрительного пигмента — его способности к регенерации в темноте при добавлении 11-^ис-ретиналя, что свидетельствует о повреждении нативной структуры родопсина. Показано также, что полностью-транс-ретиналь, связанный в фото-рецепторной мембране с фосфолипидами и родопсином проявляет меньшую фотосенсибилизирующую активность, чем свободный.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: зрительный пигмент родопсин, полностью-транс-ретиналь, фотосенсибилизаторы, фотоповреждение.

Поглощение света молекулой зрительного пигмента родопсина приводит к изомеризации его хромофорной группы, 11-^ис-ретиналя, в полностью-транс-форму. В ходе фотолиза, на стадии после образования метародопсина II, происходит гидролиз альдиминной связи Шиф-фова основания, и полностью-транс-ретиналь (АТЯ) высвобождается из белковой части молекулы — опсина [1]. Затем он восстанавливается ферментом ретинолдегидрогеназой до пол-ностью-транс-ретинола, и в таком виде перено-

Принятые сокращения: ATR — полностью-транс-ретиналь, А2-родопсин - родопсин, три лизиновых остатка которого модифицированы двумя молекулами пол-ностью-транс-ретиналя, NR-РЕ — N-ретинилиден-фос-фатидилэтаноламин, А2-РЕ — N-бис-ретинилиден-фос-фатидилэтаноламин, ATR-димер-РЕ — полностью-транс-ретиналь-димер-фосфатидилэтаноламин, А2Е — N-бис-ретинилиден-этаноламин, ДМСО — диметилсульфоксид, НСП — наружные сегменты палочек сетчатки, ДТПА — ди-этилентриаминпентауксусная кислота, ДТТ — дитиотреи-тол, ДМСО — диметилсульфоксид.

** Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 07-249, 23.12.2007.

*** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.

сится с помощью ретинолпереносящих белков из наружного сегмента палочки в клетку пигментного эпителия. Возможны также ситуации, когда, например, при избыточном обесцвечивании родопсина в наружном сегменте палочки свободный ATR накапливается в фоторецепторной мембране и взаимодействует с фосфатиди-лэтаноламином. В таком случае он может транспортироваться из фоторецепторной мембраны в виде ретинилиден-фосфатидилэтаноламина с помощью АТР-зависимого белка-переносчика (ABCR) [3-5].

При некоторых дегенеративных заболеваниях сетчатки, например при болезни Штаргардта, когда белок-переносчик (ABCR) является дефектным, ATR накапливается в фоторецепторной мембране [4-6].

Известно, что ATR является эффективным природным фотосенсибилизатором [7-9]. По механизму фотосенсибилизированного окисления ATR способен окислять белки и липиды в фоторецепторной мембране, повреждать родопсин и межфоторецепторный ретинолсвязываю-щий белок [10-14], а также мембранный белок ABCR, переносящий ATR на цитоплазматичес-кую поверхность диска [15].

Известно также, что ЛТЯ, находясь в фото-рецепторной мембране, способен вступать во взаимодействие с аминогруппой фосфатидилэ-таноламина, приводя к образованию М-ретини-лиден-фосфатидилэтаноламина — ИЯ-РЕ, и N бис-ретинилиден-фосфатидилэтаноламина — А2-РЕ [16]. Эти соединения являются предшественниками токсичного флуорофора липофусци-новых гранул — А2Е (М-Ы8-ге1:туИёепе-е1:капо-1аш1пе), снижающего устойчивость клеток пигментного эпителия сетчатки к повреждению синим светом [16—19]. Также известно, что ЛТЯ может образовывать неспецифический ковале-нтный и нековалентный комплексы с опсином/ родопсином, приводя к образованию так называемых псевдопродуктов родопсина [20—24]. Более того, показано, что ЛТЯ вступает также во взаимодействие с доступными аминогруппами родопсина, находящимися на гидрофильной цитоплазматической поверхности фоторецеп-торного диска, приводя к образованию флуоро-фора — А2-родопсина [25], у которого каждый из трех лизиновых остатков в цитоплазматичес-ком домене опсина связан с двумя молекулами ЛТЯ через пиридиновое кольцо. Недавно обнаружен еще один продукт взаимодействия двух молекул ЛТЯ с молекулой фосфатидилэтаноа-мина — полностью-транс-ретиналь-димер-фос-фатидилэтаноламин (ЛТЯ-димер-РЕ) [26].

Фототоксичные свойства продуктов взаимодействия ЛТЯ с самим родопсином и с фосфати-дилэтаноламином в фоторецепторной мембране изучены мало [27—28]. Отсутствуют данные о влиянии этих продуктов на одно из основных свойств родопсина — его способность к регенерации в присутствии экзогенного 11-цис-рети-наля. Вместе с тем, оценка степени повреждения молекулы родопсина по сохранению или нарушению его способности к регенерации является наиболее адекватным физиологическим тестом.

Реактивы. Сахароза, мочевина, Tris, диэтилен-триаминпентауксусная кислота (ДТПА), п-толу-олсульфофторид, дитиотреитол (ДТТ) диметил-сульфоксид, полностью-транс-ретиналь, гек-сан, этилацетат, ацетонитрил, вода, трифторук-сусная кислота («Sigma», США), Hepes («Serva», Германия). 11-цис-ретиналь был любезно предоставлен д.х.н. А.А. Ходоновым (ИБХФ им. Н.М. Эмануэля РАН).

Получение суспензии наружных сегментов палочек сетчатки. Наружные сегменты палочек сетчатки (НСП) были получены из свежих тем-

ноадаптированных (в течение шести часов после забоя животных) сетчаток глаз быков в соответствии с модифицированным методом препаративного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы [29].

Получение продуктов, модифицированных полностью-шранс-ретиналем — А2-родопсина и продуктов взаимодействия с фосфатидилэтанола-мином. Смесь продуктов А2-родопсина и А2-РЕ была получена согласно методике [1]. Для удаления мембраносвязанных белков НСП были суспендированы в 5,0 М мочевине (10 мМ Tris, рН 7,5) и инкубированы в течение 60 мин при 4°. Затем НСП осаждали с помощью центрифугирования (100 000 g, 60 мин). После осаждения НСП были вновь суспендированы в Hepes-бу-фере (10 мМ Hepes, 50 pM ДТПА, 100 мкМ и-то-луолсульфофторид и 1 мМ ДТТ, рН 7,0). ATR был растворен в ДМСО с конечной концентрацией 7 мМ. Модификация родопсина и фосфа-тидилэтаноламина проводилась в темноте при инкубации суспезии НСП с дву- и десятикратным избытком ATR (т.е. на одну молекулу родопсина приходилось соответственно две или десять молекул ATR) в течение трех суток при температуре 37°. В качестве контроля была использована суспензия НСП с ДМСО, инкубированная при тех же условиях, но без добавления ATR.

Регенерация родопсина. Степень нарушения нативных свойств родопсина оценивалась по его способности к регенерации после обесцвечивания суспензии НСП видимым светом и последующего добавления экзогенного 11-цис-ретиналя. В свою очередь, регенерацию родопсина в фоторецепторной мембране оценивали по восстановлению исходного спектра поглощения с максимумом 500 нм. Регенерацию родопсина проводили согласно методике [30].

К обесцвеченному видимым светом родопсину (400—700 нм, в течение различных промежутков времени: 15, 60 и 120 мин) добавляли в пятикратном молярном избытке 11-цис-рети-наль в этаноле (конечная концентрация этанола в образце составляла менее 2%). После 15 мин инкубации суспензии НСП с 11-цис-ретиналем были прописаны спектры поглощения. Затем к суспензии НСП добавляли раствор гидроксила-мина с конечной концентрацией 20 мМ. Для удаления избытка 11-цис-ретиналя его превращали в ретиналь-оксим, добавляя гидроксила-мин. Затем суспензию НСП обесцвечивали видимым светом в течение 5 мин. После каждой процедуры — обесцвечивания и последующего инкубирования в темноте в присутствии добавленного извне 11-цис-ретиналя — прописывали спектры поглощения. Степень регенерации

оценивали по формуле

= (А5р0(регенО-^р (облуч. с N[120)11)) Регенерации (А500 (темн.)-А500 (облуч. с NH20H))

Облучение образцов. Облучение образцов проводили с помощью лампы накаливания КГМ со спектром испускания видимого света 400-700 нм. Для облучения образцов в спектральном диапазоне 500-700 нм использовали фильтр ОС11. Поверхностная плотность потока световой энергии, падающей на образец, составляла 2,8 Вт/м2 для видимого света (400-700 нм) и 2 Вт/м2 для зеленого света (500-700 нм). Мощность потока световой энергии была определена при помощи фотометра «Spectra-Physics» (США), модель 407A.

Спектральные измерения. Спектральные измерения были произведены на спектрофотометре UV-1700, «Shimadzu» (Япония) и спектроф-луориметре RF-5301 PC, «Shimadzu». При проведении спектрофотометрических исследований, концентрация родопсина составляла 0,357 мг/мл. При проведении флуориметрических исследований, образец был разбавлен в четыре раза, и его поглощение составляло 0,09.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Анализ проводился с использованием хроматографического оборудования фирмы «Knauer» (Германия).

Метод экстракции изомеров ретиналя из родопсина и их анализ с помощью нормально-фазовой ВЭЖХ. Экстрагирование изомеров ретина-ля проводили согласно методу, описанному в [31]. К 2 мл образца добавляли 1 мл формальдегида, перемешивали и 2 мин инкубировали при 30°. После добавляли 1,5 мл хлористого метилена, интенсивно встряхивали и инкубировали в течение 10 мин, после чего добавляли 1,5 мл гек-сана, встряхивали, а затем центрифугировали (680 g, 10 мин). После центрифугирования отбирали средний слой, содержащий хлористый метилен, гексан и свободные изомеры ретиналя и его упаривали в вакууме водоструйного насоса. Все операции проводили при тусклом красном свете. ВЭЖХ-анализ проводили на колонк

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎