Анализ взаимодействия генов-онкосупрессоров (RB, ING1, ТР53) при онкопатологии
Охарактеризовано распределение частот аллелей и генотипов по полиморфным локусам rs1042522(G/C) гена опухолевого белка 53, rs137853294(С/G) гена ретинобластомы и rs121909250 (С/G) гена ингибитора опухолевого роста в выборке здоровых и онкобольных. Выявлены сочетания генов, повышающие риск возникновения онкопатологии. Частоты встречаемости аллельного варианта *G гена ТР53, аллельных вариантов *C и *G гена ING1, аллельного варианта *G гена RВ различаются в группе больных и группе контроля.
ВВЕДЕНИЕ В настоящее время онкологические заболевания являются одной из основных проблем здравоохранения. Так в России более 2.5 миллионов людей состоят на учете в онкологических медицинских учреждениях, и ежегодно на учет встает около 190 тысяч человек.
Раковые опухоли – это скопления интенсивно делящихся клеток. Одной из основных особенностей раковых клеток является их относительная автономность, способность к неограниченному числу делений и метастазированию. Раковые клетки не подчиняются контрольным механизмам, регулирующим жизнедеятельность нормальных клеток [2; 3; 4].
В основе канцерогенеза, вне зависимости от опухолевой локализации, лежит злокачественная трансформация клетки при нарушении контроля клеточного цикла и угнетения апоптоза [4]. Молекулярный патогенез онкологических заболеваний включает множество генетических и эпигенетических событий, ведущих к активации онкогенов и инактивации генов опухолевой супрессии [2; 3].
К одним из ключевых генов-супрессоров опухолевого роста относят гены RB, ING1, ТР53 входящих в один каскад, регулирующих работу друг жруга. Белковые продукты данных генов осуществляют реализацию широкого спектра клеточных процессов, регуляцию клеточного цикла, индукцию апоптоза, постоянный надзор за состоянием генома и злокачественной трансформацией клеток. Ген RB также является одной из мишеней трансактивационного действия гена ТР53, а следовательно, и супрессоров, участвующих регуляции активности/стабильности ТР53 и ING1. Изменение их функциональной активности ведет к накоплению повреждений ДНК и увеличению вероятности злокачественного перерождения клетки [3].
Ген ретинобластомы (RB) локализован на длинном плече 13 хромосомы - 13q14.1, и имеет протяженность в 180 т.п.н. геномной ДНК [9]. В норме он кодирует ядерный белок, фосфорилирование которого приводит к переходу клеток из G1-фазы в S-фазу и началу нового цикла репликации [16]. Инактивация или отсутствие RB-белка могут быть связаны с неконтролируемым размножением опухолевых клеток [9]. Трансверсия rs137853294 (С/G) в 20 экзоне гена RB приводит к замене аргинина на триптофан в положении 661. В ряде исследований показано, что аллель *С кодирует значительно более эффективный белковый продукт, запускающий программированную клеточную смерть [5].
Ген ING1 локализован на длинном плече 13 хромососы (13q34). Опухолевый ингибитор ING1 кодирует белок-супрессор опухолей, который может индуцировать остановку роста клеток и апоптоз. Трансверсия rs121909250 во 2 экзоне гена ING1 приводит к замене цистеина на серин в 215 положении. Эта замена может привести к разрыву 3-мерной структуры белка и нарушению функции. Белок, кодируемый аллелем *G индуцирует клеточный цикл в G1/S - контрольном пункте клеточного цикла. [16; 7].
Ген TP53 у человека локализован на коротком плече 17 хромосомы – 17р13, имеет размер в 20 кб, и состоит из 11 экзонов [12,13]. TP53 – транскрипционный фактор, ядерный белок, кодируемый одноименным геном-онкосупрессором, регулирует митотический цикл, дифференцировку клеток и их гибель при апоптозе [13]. Полиморфизм rs1042522 в гене TP53 обусловлен заменой цитозина на глицин в 72 кодоне. Обнаружено, что эффективность апоптоза выше у лиц с гомозиготной формой аллелей Arg/Arg, тогда как Pro/Prо форма индуцирует клеточный цикл в G1-фазе, определяя тем самым клеточную пролиферацию [12].
Цель настоящего исследования заключается в анализе взаимодействия различных аллельных состояний генов, которые запускают ключевые механизмы при канцерогенезе клетки.
Выборка исследования была сформирована из 562 человек проживающих в Республике Башкортостан. Из них 312 больных, находившихся на стационарном лечении в ГБУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер» МЗ Республики Башкортостан, и 250 здоровых индивидов, носителей нормальных аллелей полиморфных локусов rs1625895 (G/A), DUP16ВР гена ТР53, так как «рисковые» аллели гена ТР53 обнаруживаются с частотой от 50 до 86% при различных онкопатологиях [1]. Анкетирование и сбор венозной крови для проведения генетических исследований проводилось с согласия исследуемых людей.
Образцы геномной ДНК были выделены из 8 мл цельной венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции [10]. Типирование образцов проводили путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием олигонуклеотидных праймеров, специфичных к участку гена RB rs137853294 (F:tgggggaaagaaaagagtggtagaa, R: gaggagagaaggtgaagtgcttg), гена ING1 rs121909250 (F: gcagccccagtcactcac, R: ctgcggtgtggttggttct), гена TP53 rs1042522 (F:ttgccgtcccaagcaatggatga, R:tctgggaagggacagaagatgac).
Размеры продуктов амплификации и последующей рестрикции детектировали в 7% полиакриламидном геле. Окрашивание гелей проводили раствором этидия бромида (1%), последующую визуализацию с помощью видеогель-документирующей системы (Gel Imager). Для определения статистических параметров использовались программы MS Excel и Statistica 6.0., анализ сцепления проводили с использованием программы 2 LD (Zapata C, 2001), гаплотипический анализ – с помощью программы EH (Xiex, 1993). Различия между параметрами считались статистически достоверными при p<0,05. Межгенное взаимодействие локусов типированных генов оценивали с помощью программы Multifactor Dimensionality Reduction 2.0 (MDR 2.0), основанной на методе логистической регрессии (Moore et al., 2006).
При анализе полиморфного локуса rs137853294 гена RВ (табл.1) было выявлено 2 аллеля и 3 генотипа как в группе больных, так и в группе контроля. В группе онкобольных показано достоверно значимое повышение гомозиготного генотипа *G/*G за счет достоверного снижения частоты гетерозиготного генотипа *С/*G (p=0,0005). Повышение частоты генотипа *G/*G у онкобольных возможно связано с тем, что происходит снижение способности к взаимодействию и активации транскрипции генов-мишеней, а также низкой эффективностью апоптозa [5; 15].
Анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфного локуса rs121909250 в гене ING1 выявил 2 аллеля и 3 генотипа как в группе больных, так и в группе контроля. Была установлена следующая закономерность при распределении частот генотипов (табл.1): было выявлено достоверно значимое частоты гомозиготного генотипа *G/*G и аллеля *G (p=0,0005) у онкобольных. Также отмечено увеличение частоты встречаемости гетерозигот в группе здоровых лиц, что позволяет предполагать о протективное действие *С/*G – генотипа гена ING1 в отношении развития онкологии.
Анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфного локуса rs1042522 гена ТР53 выявил 2 аллеля и 3 генотипа в группе больных, и 1 аллель и 1 генотип в группе контроля. При сравнительном анализе было выявлено достоверно значимое увеличение частоты гомозиготного генотипа *С/*С и гетерозиготного генотипа *G/*С в группе онкобольных.
Таблица 2.
Распределение частот генотипов и аллелей генов RВ (rs137853294), ING1 (rs121909250), ТР53 (rs1042522)