. Оценка репликации и функции бета-клеток в Adenovirally-трансдуцированных изолированных островков грызунов
Оценка репликации и функции бета-клеток в Adenovirally-трансдуцированных изолированных островков грызунов

Оценка репликации и функции бета-клеток в Adenovirally-трансдуцированных изолированных островков грызунов

Этот протокол позволяет выявить факторы, которые модулируют функциональную бета клеточной массы, чтобы найти потенциальных терапевтических мишеней для лечения сахарного диабета. Протокол состоит из обтекаемой метод оценки репликации островок и функции бета-клеток островков в изолированных крыс после манипуляций экспрессии генов с аденовирусов.

Abstract

Гомеостаза глюкозы в первую очередь контролируется инсулином эндокринных гормонов и глюкагон, который вырабатывается в поджелудочной бета-и альфа-клетки, соответственно. Функциональные клеточной массы бета определяется анатомическими клеточной массы бета, а также способность бета-клеток в ответ на биогенной нагрузки. Потеря функциональной клеточной массы бета занимает центральное место как основные формы сахарного диабета 1-3. В то время как снижение функциональной бета клеточной массы результате аутоиммунной атаки на сахарный диабет 1 типа, при диабете 2 типа, это уменьшение развивается как с неспособностью бета-клетки секретируют инсулин должным образом и разрушения бета-клеток из кадровых механизмов. Таким образом, усилия по восстановлению функциональной бета клеточной массы имеют огромное значение для лучшего лечения и потенциальных методов лечения диабета.

Ведется работа по выявлению молекулярных путей, которые могут быть использованы, чтобы стимулировать репликации и повышению функции бета-клеток.В идеале, терапевтических целей позволит улучшить как бета-клеточный рост и функцию. Возможно, более важно, хотя это определить, является ли стратегия, которая стимулирует рост клеток бета происходит за счет нарушая функцию бета-клетки (например, с некоторых онкогенов), и наоборот.

Путем систематического подавления или гиперэкспрессией выражение целевых генов в изолированных островков крысы, можно выявить потенциальных терапевтических мишеней для повышения функциональной клеточной массы бета 4-6. Аденовирусных векторов могут быть использованы для эффективного гиперэкспрессией или нокдаун белка в изолированных островков крысы 4,7-15. Здесь мы представляем способ манипулировать экспрессии генов использования аденовирусной трансдукции и оценить островок репликации и функции бета-клеток островков в изолированных крыс (рис. 1). Этот метод был использован ранее для определения новых целей, которые модулируют бета репликации клетки или функции 5,6,8,9,16,17.

Protocol

1. Аденовирусные трансдукция и культивирования Крысы островков

  1. Подготовка 6-и не-культуры тканей покрытием пластины, добавив 2 мл среды (RPMI 1640 средах, содержащих 8 мМ глюкозы, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина) для необходимого количества скважин. Например, типичный эксперимент может потребовать трех скважин - по одной для не-Virus Control, вирус управления (например, GFP-экспрессирующих аденовирус), а в экспериментальной группе.
  2. Теплые пластины до 37 ° C, поместив его в культуре ткани инкубатор, по крайней мере 30 мин.
  3. Сразу же после крысы островок изоляции 18,19, место 100-200 островков в отдельных скважинах 6-и не-культуры тканей покрытием пластины. Шестьдесят островки необходимы для секреции инсулина и анализы тимидина. Остальные островки могут быть использованы для изоляции РНК для исследования экспрессии генов или белков изоляции иммуноблоттинга.

[Примечание: Начиная с этого момента, пожалуйста, следуйте институциональных протоколов для обработки, использования и утилизации биологически опасных материалов.]

  1. Осторожно вращать пластину довести островков в центре колодца.
  2. Пипетировать аденовирус непосредственно на островки в центре блюда. Используйте 100-500 кратности инфекции (МВД, соотношение клеток-мишеней к вирусным бляшкообразующих единиц).
  3. Пусть остальные островки в течение 5 мин.
  4. Поместите пластину в культуре ткани инкубатор (37 ° C, 5% CO 2).
  5. Через 24 часа, осторожно вращать пластину довести островков в центрах колодцы и передать островки помощью P200 микропипетки на новый и свежий содержащие средства массовой информации. Если островки привязываться к плите, они могут быть слегка выбили с кончика пипетки.

[Примечание: Чтобы убедиться в адекватной эффек трансдукциису, использование контроль вируса выражения GFP выгодно, так как островки могут быть отображены с помощью конфокальной микроскопии для проверки проникновения аденовирус в островок ядра.]

  1. Культура островки для дополнительных 24-72 ч, в зависимости от желаемых сроков эксперимента в исследованиях оптимизации пилота. Например, индукция пролиферативной реакции могут потребовать раз от 24-72 ч или нокдаун гена может потребоваться 48 или 72 часов. Передача островков на свежий СМИ каждый день.
  2. Для окончательного 24 часов эксперимента, культуры островков в среде, содержащей 1 мкКи [метил-3 H] -thymidine/ml средства массовой информации (как правило, 1 мкл тимидина / мл среды).

[Примечание: Начиная с этого момента, пожалуйста, следуйте институциональных протоколов для обработки, использования и захоронения радиоактивных материалов.]

2. Анализ секреции инсулина

  1. Подготовьтесекреции буфером (НКС) 10X маточного раствора (1,14 М NaCl, 47 мМ KCl, 12 мМ KH 2 PO 4, 11,6 мМ MgSO 4) и CaCl 2 100X маточного раствора (0,25 М CaCl 2). Эти растворы можно приготовить заранее и хранить при комнатной температуре.
  2. Недавно подготовить 50 мл рабочего SAB (5 мл 10X SAB, 1 мл 1 HEPES М, 0,5 мл 100X CaCl 2, 0,28 мл 35% BSA, 0,11 г NaHCO 3, и стерильной водой до 50 мл) 50 мл коническую трубку и теплой до 37 ° С, поставив в 37 ° С водяной бане.
  3. Внесите 10 мл рабочего SAB в 15 мл коническую трубку и добавьте 66,8 мкл 2,5 М D-глюкозы подготовить высокий уровень глюкозы (16,7 ммоль) SAB.
  4. Добавить 44,8 мкл 2,5 М D-глюкозы в оставшиеся 40 мл рабочего SAB подготовить низкий уровень глюкозы (2,8 ммоль) SAB.
  5. Обозначения трех 1,7 мл микроцентрифужных труб для каждой скважины 6-луночного планшета и добавить 1 мл фосфатно-солевом буфере (PBS). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Создание путей, которые можно модулировать по стимулированию репликации и повышению функции бета-клеток имеют отношение к обоим основные формы сахарного диабета. Поскольку функциональные клеточной массы бета зависит от существования и функционирования инсулин клетки, оценки этих детерминант одновременно имеет свои преимущества. Этот протокол описывает обтекаемый протокол для выявления ли гиперэкспрессия или подавление белка приводит к изменению функциональной клеточной массы бета-версии в пробирке, которые затем могут быть проверены на эффективность в естественных условиях.

Один из недостатков этого протокола является то, что островок представляет собой микро-орган, состоящий из многих типов клеток, включая, но не ограничиваясь альфа, бета, дельта, эпсилон, и ПП клетки. Изменение островок репликация не может полностью перевести на изменения в бета репликации клетки, так как 80-90% клеток у крыс островок являются бета-клеток. Возможность того, что наблюдаемые изменения в островкеРепликация в связи с не-бета-клеток репликации существует. Таким образом, логический и подтверждающие следующий шаг в этом протоколе может быть изучение бета-клетки репликации с использованием аналогов тимидина связан с иммунофлюоресценции или FACS анализ 5,6. Этот подтверждающий анализ может также облегчить потенциальную опасность неспецифических тимидина в островки независимой распространения.

Другой потенциальный недостаток заключается в трансдукции эффективность аденовирусы. Трансдукция эффективность 60-70% является разумным достичь, но ключевым фактором, определяющим эффективность сроки аденовирусной трансдукции. Важно, чтобы культура изолированных островков в аденовирусы как можно скорее, чтобы максимизировать эффективность трансдукции. Через несколько часов после того, как островок изоляции островок начинает сокращаться, тем самым ограничивая способность аденовируса проникать глубоко в ядре островок. Использование репортер конструкции, такие какаденовирус выражения GFP, в сочетании с конфокальной микроскопии могут быть полезны для оценки эффективности трансдукции.

Основными преимуществами этого протокола являются: 1) эффективность тестирования нескольких детерминант функциональной клеточной массы бета-версии на одном пуле островков и 2) небольшое количество островков, необходимые для выполнения протокола (типичный изоляции островок крысы дает 400 островков) . Эти преимущества позволяют это протокол, который будет использоваться в качестве скринингового инструмента для нескольких генов в умеренном темпе.

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎