Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему: Цитогистологический анализ последствий опистоорхозной инвазии, сопровождающейся персистенцией вируса Эпштейна-Барр
Автореферат диссертации по медицине на тему Цитогистологический анализ последствий опистоорхозной инвазии, сопровождающейся персистенцией вируса Эпштейна-Барр
Не правах рукописи
Плышских Екатерина Ннколаевна
ЦИТОПКТОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОСЛЕДСТВИЙ ОПИСГОРХОЖОЙ ИНВАЗИИ, СОПРОВОЖДАЮЩЕЙСЯ ПЕРС ИСТЕНЦИЕЙ ВИРУСА ЭПШТЕЙНА-БАРР
14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология 14.00.10 - инфекцноимые болезни
Работа выполнена в Сибирском медицинском университете, г. Томск
доктор медицинских наук, профессор Логвинов C.B. доктор медицинских наук, профессор Лепехин A.B.
доктор медицинских наук, профессор Суходоло И.В. доктор медицинских наук, профессор Белов Г.Ф.
Ведущая организация: Новосибирский медицинский институт
Защита состоится « tâ été _1999 г._ч. на заседании
диссертационного совета К 084.28.01 при Сибирском медицинском университете по адресу: 634050, г.Томск, Московский тракт, 2
С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского медицинского университета (634050, г. Томск, пр. Ленина, 107).
А втореферат разослан « »___1999 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент
Актуальность проблемы. Описторхоз - заболевание, вызываемое трематодой Opistorchis felineus, в ряде областей России приобрело значение краевой патологии. Показано, что описторхозная инвазия вызывает значительные изменения в гепатобилиарной системе и предрасполагает к развитию хронического панкреатита, гастрита, язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, пилородуодекита (Озерецковская H.H. с соапт., 1971, 1972; Белобородова Э.И. с соапт., 1996), а также способствует развитию рака поджелудочной железы, большого дуоденального соска и печени (Белозеров Е.С., 1981; Лепехин A.B. с соавт., 1992). Кроме того, установлено, что описторхозная инвазия сопровождается значительным увеличением числа клеток с цитогенетическими нарушениями (Ильинских H.H. с соавт., 1981, 1984; Бычков В.Г.. 1992; Кудрявцев Д.П. 1992; Степанова Т.Ф., 1998). Поскольку описторхис не может непосредственно воздействовать на генетический аппарат клеток организма, возникает обоснованное предположение, что цитогенетические поражения, наблюдаемые при опис-торхозион инвазии, обусловлены опосредованными механизмами. Известно, что способностью индуцировать цитогенетические нарушения за счет непосредственных механизмов обладают вирусы. Имеются литературные данные, согласно которым описторхис может находиться в ассоциации с вирусом простого герпеса (Иванских В.И.-, Близнюк В.В., 1996). В связи с этим, обращают на себя* внимание результаты исследований • представленные В.Д. Подоплекиным (1939, 19913) и СЛО.Ильиным (1995), свидетельствующие о том,.что у жителей населенных пунктов в бассеинах рек Обь, Иртыш и Томь, где пораженность местного населения достигает- 86,5% (Генецинская Т.А., 1978), наблюдается усиление циркуляции потенциально онкогенного вируса Эпштейна-Барр (ЭБ), также относящегося к семейству герпесвирусов. Поэтому нельзя исключить, что.вирус ЭБ, возможно, играет определенную роль в патогенезе описторхозной инвазии. Результаты исследований в этом направлении, по-видимому, могут позволить внести некоторые коррективы в существующие представления о патогенезе опис-торхоза.
Цель и задачи исследования. Цель работы - изучить роль вируса ЭБ в цитогйсгологических и цитогенетических изменениях прн хроническом описгорхозе.
Для реализации этой цели был» поставлены следующие задачи;
I. Исследовать роль вируса ЭБ в цитогенетических последствиях при описторхозиой инвазии у человека и экспериментальных животных.
2. Изучить цитогенетичесхие последствия сочетанного воздействия вируса ЭБ и антигенов описторхисов в условиях культуры лимфоцитов человека, стимулированной к делению фитогемагглютшшном.
3. Изучить miro- и гистологические изменения печени людей, больных хроническим описторхозом и инвазироваиных маритами с инкорпорированным вирусом ЭБ, а также в печени экспериментально инвазироваиных животных, которых одновременно заражали вирусом ЭБ.
4. Изучить особенности Эпштейн-Барр внрусспецифнческого иммунного ответа у больных хроническим описторхозом.
Научная новизна работы. Впервые установлено, что у больных хроническим описторхозом наблюдается достоверное повышение уровня антител к антигенам вируса ЭБ по сравнению со здоровыми людьми. Особенно высокие титры антител к капсидному антигену вируса ЭБ отмечены у больных с суперинвазнонной формой описторхоза, с продолжительностью инвазии более 10 лет, а также с хроническими тонзиллитами и фарингитами. При этом у больных описторхозом с высокими титрами G-антител к капсидному антигену Вируса ЭБ с помощью метода непрямой реакции иммунофлюоресценции антигены вируса ЭБ были обнаружены в ядрах эпителиальных клеток ротоглотки. Кроме того, в вышеназванной группе больных выявлены наиболее значительные кариопатологические и цитогенетические изменения в эпителиоцитах ротоглотки и лимфоцитах периферической крови. Аналогичные нарушения были отмечены в культурах лимфоцитов, полученных от здоровых людей после заражения вирусом ЭБ и введения антигенов описторхисов. Специфическая иммунофлюоресценция капсидного антигена вируса ЭБ выявлена также в яйцах Opisthorchis felineus у людей с массивной интенсивностью инвазии. Морфологическое исследование печени людей больных описторхозом, инвазироваиных маритами с инкорпорированными антигенами вируса ЭБ, свидетельствуез о наличии характерного для этого заболевания холангита, морфологически проявляющегося в виде аденоматозного разрастания эпителия слизистой оболочки внутрипеченочных желчных протоков, десквамации эпителиальных клетох в местах контакта гельминта с их стенкой, а также воспалительной реакции и признаков склероза соединительной ткани по ходу желчных протоков.
Теоретическое и практическое значение. Полученные в настоящем исследовании данные о механизмах возникновения цитогенетических нарушений при описторхозиой инвазии вносят новые сведения в существующие
представления о патогенезе описторхоза и могут служить основанием для разработки новых, патогенетически обоснованных подходов к терапии данного заболевания. Роль вируса ЭБ в описторхозной инвазии должна учитываться специалистами при определении тактики лечения больных описторхозом, поскольку показана связь между уровнем антител к антигенам вируса ЭБ и кпнническим вариантом течения хронического описторхоза. Определение уровня антител к антигенам вируса ЭБ вместе с цитогене-тическими исследованиями (хромосомный анализ, микроядерный тест, исследование патологии митоза и ядра) у больных описторхозом могут использоваться в качестве дополнительных диагностических тестов для прогнозирования риска развития неопластической трансформации.
Внедрение результатов работы в практику. Результаты исследования используются в обучении студентов и клинических ордннаторов по разделу "Гельминтозы" на кафедре инфекционных болезней и эпидемиологии Сибирского медицинского университета.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. У больных хроническим описторхозом с высокими титрами антител к антигенам вируса Эпштейна-Барр повышено количество Т-лимфоцитов с цитогеиетичесхими нарушениями в периферической крови.
2. Хромосомные нарушения у больных описторхозом с высокими титрами антител к капсидному антигену вируса Эпштейна-Барр преимущественно локализуются в определенных зонах хромосом 2,3, б, 8, 14, и 22.
3. В условиях культуры лимфоцитов здоровых доноров введение вируса Эпштейна-Барр вместе с антигенами, описторхисов вызывает значительные кариопатологнческие и цитогенетические измекеиия клеток.
4. С помощью непрямой реакции иммунофлюоресценции выявлено специфическое свечение ка'псидиого:.антигена вируса Эпштейна-Барр в эпителиальных клетках ротоглотки у людей, имеющих высокие титры антител к этому вирусу, а также и яйцах Ор^ШогСМэ &1шеи$.
5. Морфологическое нсследование печени людей больных описторхозом, инвазированных маритами с инкорпорировани'ыми антигенами вируса ЭБ, свидетельствует о наличии характерного для 'этого заболевания холангита, морфологически проявляющегося в виде аденоматозного разрастания эпителия слизистой оболочки внутрипеченочных желчных протоков, десква-мации эпителиальных клеток в местах контакта гельминта с их стенкой, а также воспалительной реакции и признаков склероза соединительной тхани по ходу желчных протоков.
6. Наиболее высокий уровень антител к антигенам вируса Эпштейиа-Барр обнаружен у больных суперинвазионной формой хронического опи-сторхоза.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на: 2-ой международной научно-практической конференции "Безопасность жизнедеятельности в Сибири и на крайнем Севере", Тюмень 1997; 13-ой российской научной конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях", Челябинск, 1997 ; Всероссийской научно-практической конференции "Экологоэавйсимые заболевания (биохимия, фармакология, клиника)", Чита, 1997; Юбилейной конференции "Медико-биологические аспекты нейро-гуморальной регуляции", посвященной 35-летию ЦНИЛ, Томск, 1997; 2-ой республиканской научно-практической конференции, посвященной 75-летию инфекционной службы Удмуртии, Ижевск, 1998; Конференции, посвященной 50-летию кафедры детских инфекций СГМУ, Томск, 1998; 6-ой научно-практической конференции "Актуальные вопросы гастроэнтерологии и особенности заболеваний органов пищеварения в Сибирском регионе", Томск, 1998; Mutation Detection'97, The 4th International workshop, Bmo, Czech Republic, 1997; The Society of Environmental Toxicology and Chemistry (SETAC), 18th Annual Meeting, San Francisco, CA, 1997; The International Symposium on Environmental Epidemiology in Central and Eastern Europe: Critical Issues for Improving Health, Smolenice, Slovak Republic, 1997; Conference on Genetic aspects of autoimmune diseases, Noordwijkerhout, The Netherlands, 1998; The ISth Annual Meeting of the European Association for Cancer Research (EACR), Stockholm, Sweden, 1998; The 10th NCI-EORTC Symposium on New Drugs in Cancer Therapy, Amsterdam, 1998.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, четырёх глав, списка литературы из 236 наименований, из которых на- иностранных языках - 125, а также включает в себя 41 рисунок и 20 таблиц.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Обследован 61 больной хроническим описторхозом, имеющих средний возраст 37,7±3,6 лет, из них мужчин - 28, женщин - 33. В качестве контроля обследовали 63-х здоровых людей, имеющих сопоставимый с основной группой возраст и пол. У 43-х больных был диагностирован неотягощен-
ный хронический описторхоз, а у 18 больных - суперинвазионный хронический описторхоэ.
Для изучения цитогенетических и морфологических изменений при экспериментальном описторхозе у морских свинок использовалось три опытных группы по 20 животных в каждой и 20 контрольных животных. Первая опытная группа включала животных, экспериментально инвазированных О. felineus, вторая группа - зараженных вирусом ЭБ, а третья группа состояла из животных одновременно зараженных описторхисами и вирусом ЭБ. Описторхоз у морских свинок был воспроизведен посредством введения в глотку 30 метацеркариев О. felineus. Заражение животных вирусом ЭБ проводили одновременно с введением метацеркариев О. felineus путем внутри-брюшинной инъекции 2 мл (по 25 тыс. внруспродуцирующих клеток в 1 мл) суспензионной вируспродуцирующей линии PjHR-l, полученной из лаборатории онковирусологии НИИ онкологин ТНЦ СО РАМН. Через I месяц у морских свинок брали мазки крови и мазки-отпечатки печени для микроядерного анализа, а также кусочки печени для гистологического исследования.
Для эксперимента в условиях in vitro использовались культуры Т-лимфоцитов периферической крови, стимулированные к делению фитоге-магглютинином (ФГА), которые получали от б здоровых людей, серонега-тивных к вирусу ЭБ. Половину приготовленных для культивирования образцов предварительно заражали вирусом ЭБ путем введения в культуру Т-лимфоцитов суспензионной вируспродуцирующей линии PjHR-1 (25 тыс. клеток на I мл культуры). Через 24 часа после начала культивирования в питательную среду вводили антигены марит описторхисов, извлеченных из печени трупов людей, умерших от острого нарушения мозгового кровообращения. В эксперименте использовалось два антигена из марит описторхисов: соматический и яичный, полученные по методу изложенному в работе А.Т. Котелкина с соавт. (1997). В антигенах определяли содержание белка по методу И.О. Lowry et al. (1951) (0,5 мг/мл) и вносили в зараженные и неза'раженные вирусом ЭБ культуры лейкоцитов по 0,1 мл антигена на 2 мл культуральной среды (2,5»10-8 кг белка/мл). Через 72 часа после начала культивирования проводилось цитогенетическое и цитологическое изучение клеток культуры.
Гистологические методы использовали при изучении печени интакт-ных и экспериментально инвазированных морских свинок и 10 умерших от острого нарушения мозгового кровообращения людей с диагностированным хроническим описторхозом, инвазированных маритами с инкорпорированным вирусом ЭБ. В качестве контроля использовался материал, по-
лученный от 10 умерших людей без признаков опиоторхоза на вскрытии. Вскрытие во всех случаях проводилось не позднее, чей через 12 часов после смерти. Кусочки левой и правой долей печени от животных и людей фиксировали в жидкости Карнуа. Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином н эозином. Гликоген и нейтральные гликопротеины в гепа-тоцнтах выявляли с помощью ШИК-реакции по Мак-Манусу. Для ультрамикроскопического анализа изменении в клетках печени животных материал фиксировали в 2% глютаральдегиде, забуфереьном на 0,2 М какоди-латном буфере (pH 7,2). Затем постфиксировали в 2% растворе четырехо-киси осмия, дегидратировали в спиртах возрастающей крепости и заливали в эпон. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе JEM-I00CX (Япония).
Определяли число эритроцитов с микроядрами в периферической крови людей и экспериментальных животных согласно W. Schmid (1975). Кроме того, у 58 больных и 63 здоровых людей проводился кариопатоло-гический анализ в эпителиоцитах задней стенки глотки. Мазки окрашивали азурИ-эозином. Подсчёт числа эритроцитов с микроядрами производили в 10000 клеток, числа клеток с кариопатологиеи - в 100 клетках.
Рутинный хромосомный анализ у 58 больных и 63 здоровых людей проводили согласно Р. Moorhead et al. (1960). Препараты окрашивали азурН-эозином. У каждого человека или варианта опыта в условиях in vitro анализировали не менее 100 метафаз. Дифференциальное окрашивания хромосом проводили у 25 больных хроническим описторхозом и у 52 здоровых доноров. Использовали технику G-бэндов согласно М. Seabright (1971).
В качестве тест-системы для выявления титров антител к антигенам вируса ЭБ использовали фиксированные препараты суспензионной клеточной вируспродуцирующей линии - РзНК-1. Уровни антител к антигенам вируса ЭБ определяли в непрямой реакции иммунофлюоресценции по модифицированному методу W. Heule и G. Henle (1979). Для определения содержания хапсидного антигена вируса ЭБ в маритах О. felineus и клетках эпителия задней стенки глотки у 20 больных описторхозом людей, а также в маритах описторхисов использовалась непрямая реакция иммунофлюоресценции. Для этого полученный материал фиксировали охлажденным ацетоном. В качестве специфической сыворотки применяли несколько вы-сокотитражных сывороток к капсидному антигену ЭБ. Дальнейшая методика не отличалась от метода, использованного для определения вирусспе-цифнческих антител. Для контроля на специфичность свечения использовали негативную тест-сыворотку, позитивную тест-сыворотку (только для
определения антител) и античеловеческий иммуноглобулин, меченный флюоресцеинизотиоционатом.
Определение уровня альфа-фетопротеина (АФП) проводили с использованием иммуиофсрментного теста фирмы "HofTman La Roche" согласно методическим рекомендациям Всесоюзного онкологического научного центра РАМН (1989).
Содержание малонового днальдегида определяли согласно методу Ю.А. Владимирова и А.И. Арчакова (1972), диеновые конъюгаты определяли по В.Б. Гаврилову и М.И, Мишкорудной (1983). Определение активности ка-талазы в сыворотке крови проводилось по методу М.А. Королюк и Л.И. Ивановой (1988). Антиокислительную активность липидов изучали согласно методу А.П. Левицкого и Л.М. Шафран (1983).
Все результаты исследования обрабатывали статистически с использованием t критерия Стыодента, %г и корреляционного анализа с использованием коэффициента корреляции рангов Спирмена, при этом руководствовались описгнием статистических методов, изложенных в пособиях В.Е. Монцевичюте-Эрингене (1964), Е.В. Гублера, A.A. Генкина (1973) и Г.Ф. Лакина (1980). Среднегеометрический титр антител к антигенам вируса Эпштейна-Барр определялся согласно И.П. Ашмарину и A.A. Воробьеву (1962).
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Клинико-лабораторная характеристика больных хроническим опистор-
хозом. серопозитивкых к вирусу Эпштейна-Барр Полученные данные свидетельствуют, что все обследованные больные описторхозом имели антитела класса G к вирускапсидному антигену (BKA) вируса ЭБ в титре от 1:20 до 1:1280. Высокие титры антител (1:320 и более) не наблюдались у здоровых людей (контроль), в то время как, среди больных хроническим описторхозом они встречались у 41%. Из них у больных с явлениями холепатии выявляемость высоких титров G-антител к BKA не превышала 8,3%, у больных с гастродуоденопатическим вариантом - 16%. В то же время, у больных с панкреатопатией этот показатель составил 67%, а у больных с отягощенным течением (суперинвазией) достигал 89%.
Выявляемость А-антител к BKA и G-антител к комплексу ранних антигенов ЭБ у многих больных описторхозом также значительно возрастала (соответственно 34 и 57% при 3%-в. контроле), что вместе с повышением .титров G-антител к ВКА могло свидетельствовать о реактивации ЭБ-инфекции. Среднегеометрический титр G-антител к ВКА вируса ЭБ, у людей больных хроническим описторхозом (2,212±0,059, данные приводятся в
десятичных логарифмах) был достоверно выше, чем в контрольной груп-пе( 1,581 ±0,066; Р<0,001).
Среднегеометрические титры А-аитител к BKA вируса ЭБ (0,412±0,074), а также тнтры G-антител к комплексу ранних антигенов вируса ЭБ (0,650±0,082) у больных хроническим описторхозом были достоверно выше, чем в контрольной группе (соответственно 0,032±0,009 и 0,033+0,009; Р<0,001). Установлено, что выяаляемость высоких титров (1:320 и более) у больных с продолжительностью инвазии до 10 лет не превышала 30%, а у люден с продолжительностью инвазии более 10 лет составила 59%. Кроме того, среднегеометрический титр G-антител к BKA вируса ЭБ у больных с продолжительностью инвазии более 10 лет (2,412±0,099) был наибольшим и достоверно отличался не только от контроля (1,581±0,066; Р<0,001), но и от больных с продолжительностью инвазии до 10 лет (2,064±0,095; Р<0,05). В группе больных, у которых был выявлен хронический фарингит и тонзиллит, среднегеометрический титр антител к BKA вируса ЭБ был достоверно выше (2,292±0,080;Р<0,01), чем у больных без признаков воспаления со стороны миндалин и слизистой задней стенки глотки (2,028±0,084).
При изучении средних уровнен АФП у больных хроническим описторхозом в зависимости от титра G-антител к BKA вируса ЭБ достоверные отличия от контрольной группы (1,8±0,3; Р<0,001) были выявлены только у больных с высокими титрами антител (2,6±0,57). Кроме того, уровень этого показателя в группе больных с высокими титрами антител был достоверно выше, чем в группе больных с низкими титрами (1,б±0,28;Р<0,05).
В общем анализе крови у больных хроническим неотягощенным описторхозом, имеющих высокие титры антител к BKA вируса ЭБ, отмечалось достоверное снижение содержания эритроцитов (3,9±0,1 у мужчин и 3,8±0,07»10"/л у женщин) по сравнению с группой больных с низкими титрами (соответственно 4,5±0,03 и 4,0±0,05«10'Ул; Р<0,01), а также по сравнению с контролем (соответственно 4,8±0,1 и 4,3±0,08»101г/л; Р<0,01). У больных с суперинвазней (с высокими титрами антител к BKA вируса ЭБ) наблюдалась эозинофилия (29,914,8%) и нейтропения (33,б±2,4%) в периферической крови;
Уровень антиоксидантной активности липндов (АОА) по а-токоферолу был достоверно снижен у больных хроническим описторхозом с высокими титрами антител к BKA вируса ЭБ (10,0±0,5 мкэкв/мин*мл) по сравнению с группой больных, имеющих низкие титры (12,0±0,2 мкэкв/мин*мл; Р<0,01), а также с серопозитивным и серонегатнвным контролями (соответственно 15,2±0,1 и 15.6±0,2 мкэкв/мин»мл; Р<0,01). Аналогичные изменения наблюдались в отношении каталазы. У больных хроническим описторхозом.
имеющих высокие титры антител, уровень этого показателя составил 16,1±0,5 мкат/л при 22,1+0,25 в серопозитивном и 22,0±0,6 мкат/л в сероне-гативном контролях (Р<0,01). Наиболее выражено ЛОА и кагалаза были снижены у больных с суперинвазией (соответственно 9,3+0,2 мкзкв/мин*мл и 14,6+0,4 мкит/л). Уровень малонового диальдегида достоверно повышался у больных хроническим описторхозом с высокими титрами антител (6,1±0,3) и у больных с суперкнваэиеи (7,1±0,2 мкмоль/л) по сравнению с серопозитивным (3,0±0,04; Р<0,01) и серонегативным (2,0+0,4 мкмоль/л; Р<0,01) контролями. Однако достоверных отличий между группами больных хроническим описторхозом с высокими и низкими титрами антител отмечено не было. Уровень диеновых конъюгатов был также достоверно повышен у всех групп больных описторхозом по сравнению с контролем •(Р<0,01). Кроме того, группа больных хроническим описторхозом, имеющая высокие титры антагел к вирусу ЭБ