Коронавирусы собак и кошек: генетика, жизненный цикл и проблемы диагностики
Таксономия. Свое название коронавирусы получили в 1968 г. из-за коронаобразного внешнего вида, описанного по фотографиям, сделанным при проведении электронной микроскопии. В 1975 г. семейство Coronaviridae было зарегистрировано Международным комитетом по таксономии вирусов. Семейство Coronaviridae подразделяется на 2 подсемейства: коронавирусы и торовирусы. Последние вызывают кишечные заболевания у коров и, возможно, у людей. Коронавирусы включают три рода (I-III), это разделение изначально было основано на серологических перекрестных реакциях, а более поздние молекулярно-генетические исследования подтвердили его. В группу I входят патогены животных, такие как коронавирус свиней, вирус инфекционного перитонита кошек, а также коронавирусы человека, вызывающие респираторные заболевания. Группа II также включает патогены ветеринарного значения, такие как BCoV, гемагглютинирующий вирус энцефаломиелита свиней, коронавирус лошадей, а также человеческие коронавирусы, вызывающие респираторные инфекции. Также в эту группу входят вирусы, которые инфицируют мышей и крыс. В группу III на сегодняшний момент входят только коронавирусы птиц. Морфология. Коронавирусы представляют собой оболочечные вирусы с округлыми и иногда плеоморфными вирионами диаметром приблизительно 80-120 мкм. Эти вирусы содержат РНК с самым большим РНК-геномом (приблизительно 30 т.п.о.), известным на сегодняшний день. Геномная РНК образует комплексы с основным белком нуклеокапсида, в результате чего формируется спиральный капсид, находящийся внутри вирусной мембраны. Мембраны всех коронавирусов содержат по меньшей мере три вирусных белка. Это так называемые spike (S), гликопротеин I типа, образующий пепломеры на поверхности вириона, придающие коронаобразную морфологию вирусу; мембранный (М) белок и маленький мембранный белок (Е).
Геном всех коронавирусов обладает одинаковой структурой. На 5’ конце 20-22 т.п.о. содержат ген репликазы, в котором закодированы многочисленные ферментативные активности. Продуктами этого гена являются два больших полипептида, pp1a и pp1ab. Структурные белки закодированы на 3’ конце генома и занимают одну треть от всего генома. Жизненный цикл вируса. Коронавирусы, попав в организм, контактируют со специфическими клеточными рецепторами хозяина с помощью своего spike-белка. Это запускает изменения структуры spike, что в свою очередь приводит к слиянию между вирусной и клеточной мембраной, а это заканчивается введением нуклеокапсида в клетку хозяина. При проникновении в клетку хозяина начинается активная трансляция гена репликазы на рибосомах в цитоплазме. Получающиеся многочисленные ферменты, как считается, играют роль в метаболизме РНК коронавируса и/или во взаимодействии с процессами, происходящими в клетке хозяина. При инфицировании коронавирусами, так же как и для всех остальных РНК- содержащих коронавирусов, должна происходить репликация генома вируса и транскрипция РНК. Репликация генома вируса включает синтез полноразмерной отрицательной нити РНК, которая присутствует в низкой концентрации и служит матрицей для полноразмерной геномной РНК. После трансляции всех вирусных белков собирается нуклеокапсид вируса, который одевается оболочкой. Затем вирусные частицы транспортируются на поверхность клетки, где они покидают клетку.
Роль белков коронавируса в патогенезе Spike. С помощью spike-белка коронавирусы прикрепляются к специфическим клеточным рецепторам. Это запускает изменения структуры spike, что в свою очередь приводит к слиянию между вирусной и клеточной мембраной. Spike-белок коронавируса играет существенную роль в проникновении вируса в клетку, распространении от клетки к клетке, а также определяет тропизм к ткани. Способность коронавируса реплицироваться в определенных типах клеток зависит только от способности взаимодействовать с рецепторами этого типа клеток. Также было показано, что spike является главной детерминантой патогенности. Мембранный белок. М-белок является основным белком мембраны вириона. Считается, что М-белок, кроме выполняемой им роли в сборке вирусных частиц, влияет на взаимодействие с клеткой хозяина. Белок нуклеокапсида. Является структурным белком, но также принимает участие в транскрипции и патогенезе. Экспрессия N-белка необходима для эффективного образования вирусных частиц из копий ДНК. Маленький белок оболочки. Е-белок является интегральным мембранным белком. Вместе с М-белком он играет важную роль в сборке вирусных частиц. Возможно, из-за активности катион-селективного ионного канала он может усиливать интенсивность вирусного морфогенеза и сборку вирусных частиц. Предполагается, что Е-белок играет роль во взаимодействии вируса и клетки хозяина, индуцируя апоптоз. Белки-репликазы. Эти белки способны влиять на тропизм и патогенез с помощью определения степени вирусной репликации, возможно, через взаимодействие с некодирующими последовательностями вирусного генома, специфическими факторами клеточных типов или с факторами иммунного ответа. Некоторые ферментативные активности могут быть вовлечены в разрушение многих аспектов метаболизма клетки хозяина.
Коронавирусная инфекция кошек
Диагностика кошачьего коронавируса Основные диагностические тестыСерология
Измерение уровня антител в сыворотке является важным диагностическим инструментом для обнаружения FCoV. Однако, поскольку большой процент здоровых кошек обладает антителами к FCoV, тестирование на наличие антител скорее помогает при мерах по избавлению от инфекции, вызванной FCoV (например, выведения из питомника зараженных животных). Исследование уровня антител у кошек, которые предположительно больны FIP, обладает ограниченным значением для подтверждения диагноза, и результаты следуетинтерпретировать с осторожностью. У некоторых кошек с влажной формой FIP наблюдаются низкие титры или даже полное отсутствие антител к FCoV. Это происходит из-за того, что большое количество вируса в организме кошки связывается с антителами и делает их недоступными для антигена или из-за того, что антитела отсутствуют в асцитной жидкости. Использование анти-7b белков для серологических исследований не имеет какого-либо значительного преимущества. Поскольку FIP является заболеванием, опосредованным иммунной системой, комплексы антиген-антитело могут циркулировать в сыворотке и асците. Циркулирующие комплексы можно обнаружить с помощью конкурентного ИФА. Однако ценность этого исследования ограничена, поскольку прогностичность положительного результата невысока (67%) и наблюдается очень много ложноположительных результатов (Sharif et al., 2010).
Полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (RT-PCR) Существует множество публикаций, в которых описано обнаружение FCoV с помощью RT-PCR. Некоторые авторы используют праймеры, комплементарные консервативным участкам вирусного генома, таким как Pol, ген 7b, а также 3' нетранслируемый участок (3' UTR). Тесты RT-PCR, в которых используются такие праймеры, способны обнаружить большинство, если не все штаммы FCoV, и являются значимым инструментом для скрининга вируса в популяциях кошек. В связи с тем что последовательность гена S различается у серотипов I и II, некоторые тест-системы RTPCR конструируют таким способом, чтобы различить эти серотипы FCoV. Поскольку специфические генетические детерминанты биотипов FCoV неизвестны и геном содержит различные однонуклеотидные замены (SNPs), невозможно создать праймеры для ПЦР, с помощью которых можно различать FIPV и FECV и таким образом определять случаи FIP- и FCoV-положительных здоровых кошек. Тест-системы ПЦР, которые используются для обнаружения FCoV в образцах фекалий, являются и чувствительными, и полезными для информации, что у кошки в кишечнике присутствует FCoV. Интенсивность сигнала RT-PCR в фекалиях коррелирует с количеством вируса, присутствующего в кишечнике. Сравнения между образцами РНК, выделенными из суспензии фекалий и суспензии культивированных FCoV- инфицированных клеток, продемонстрировали наличие в фекалиях факторов, которые ингибируют реакцию обратной транскрипции. Вирус может быть обнаружен в различных тканях и асцитной жидкости. Как считается, наиболее вероятно обнаружение FCoV в печени (48%) и селезенке (42.3%), чем в почках (21.1%). Вдобавок количество РНК, выделенное из свежих тканей, значительно выше, чем из тканей, зафиксированных формалином, этанолом или раствором Буэна. Было обнаружено, что праймеры, сконструированные таким способом, чтобы обнаруживать FIP у больных кошек, способны амплифицировать FCoV у здоровых кошек. Таким образом, результаты RT-PCR следует интерпретировать в соответствии с клиническим статусом кошки, и ПЦР нельзя использовать как единственный тест для диагностики FIP. Существует несколько правдоподобных объяснений ложноотрицательных результатов RT-PCR, включая деградирование РНК, непрохождение реакции обратной транскрипции, а также различия в нуклеотидных последовательностях FCoVs. Инфицирование CCV (коронавирус собак) или TGEV также может объяснить ложноположительные результаты, поскольку эти вирусы обладают высококонсервативными участками.
Гистопатология и иммуноцитохимия Коронавирусная инфекция собакКоронавирусный энтерит собак. В настоящее время известно 2 генотипа коронавируса, вызывающего энтерит у собак, CCoV-I и CCoV-II. Гомология этих генотипов составляет 96%, однако у них весьма различаются последовательности гена белка spike. Проведенный анализ выявил, что оба этих генотипа одновременно присутствуют в кишечнике зараженной собаки. В 2005 г. в Италии был описан высоковирулентный пантропический штамм CCoV-II, вызывающий в отличие от обычных генотипов системное заболевание, сопровождающееся летаргией, потерей аппетита, рвотой, кровавой диареей, тяжелой лейкопенией и неврологическими симптомами с последующей смертью через два дня после проявления симптомов. Вскрытие показало наличие тяжелых обширных повреждений легких, печени, селезенки и почек. Респираторный коронавирус собак. Идентифицирован в 2003 г. в респираторном тракте собак из английского питомника. Наиболее близок к бычьему коронавирусу, а гомология с кишечным коронавирусом собак составляет всего 21%. Заражение этим коронавирусом вызывает умеренные респираторные симптомы. Вирус является одним из этиологических агентов питомникового кашля.